Supervivencia del liquen Xanthoria parietina en condiciones ambientales marcianas simuladas

Jun 14, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 4893 (2023) Citar este artículo

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Xanthoria parietina (L.) Th. Padre es un liquen foliáceo muy extendido que muestra una alta tolerancia a la radiación UV gracias a la parietina, una sustancia secundaria del liquen. Expusimos muestras de X. parietina en condiciones marcianas simuladas durante 30 días para explorar su capacidad de supervivencia. La vitalidad del liquen se controló a través de la clorofila, una fluorescencia que da una indicación de la reacción activa a la luz de la fotosíntesis, realizando análisis in situ y después del tratamiento. Se utilizaron espectroscopia Raman y TEM para evaluar la conservación de carotenoides y las posibles variaciones en la ultraestructura del fotobionte, respectivamente. Se observaron diferencias significativas en la fotoeficiencia entre las muestras irradiadas con UV y las muestras mantenidas en la oscuridad. Valores de fluorescencia correlacionados con temperatura y humedad ciclos día-noche. La recuperación de la fotoeficiencia mostró que la radiación UV causó efectos significativos en la reacción de luz fotosintética. La espectroscopia Raman mostró que la señal de carotenoides de las muestras expuestas a los rayos UV disminuyó significativamente después de la exposición. Las observaciones de TEM confirmaron que las muestras expuestas a los rayos UV fueron las más afectadas por el tratamiento, mostrando una desorganización de los cloroplastidios en las células de los fotobiontes. En general, X. parietina pudo sobrevivir a las condiciones simuladas de Marte y, por este motivo, puede considerarse candidata para la exposición espacial a largo plazo y las evaluaciones de la fotodegradabilidad de la parietina.

Dos de los temas astrobiológicos candentes propuestos por la hoja de ruta europea de astrobiología (proyecto AstRoMap) son el estudio de los límites de la vida en entornos extremos simulados/reales y el estudio de biomoléculas particulares que podrían representar biomarcadores de formas de vida presentes/pasadas fuera de la Tierra. biosfera1. Investigar los límites de la vida en ambientes estresantes permite explorar los efectos fisiológicos y bioquímicos de condiciones extremas en muestras biológicas2. En los últimos treinta años, los biólogos se dieron cuenta de que los hábitats muy extremos e inhóspitos pueden albergar vida3. El estudio de los extremófilos, capaces de sobrevivir en condiciones críticas, y de las especies pioneras, aquellos primeros ambientes colonizadores, fue crucial en el desarrollo de la astrobiología4,5. Entre ellos, los líquenes han demostrado prosperar y sobrevivir en algunos de los hábitats más extremos de la Tierra3,6,7,8,9,10. Por lo tanto, la ecofisiología de estos organismos podría dar una indicación sobre su potencial plasticidad adaptativa en la perspectiva del cambio climático, escenarios geológicos terrestres pasados ​​(y futuros)11 y hábitats extraterrestres como la superficie de Marte y los exoplanetas.

Varios estudios demostraron la resistencia de los líquenes cuando se exponen al espacio y a condiciones similares a las de Marte. La alta resistencia de los líquenes a condiciones extremas se debe a sus principales características ecofisiológicas (poiquilohidria y anhidrobiosis) y procesos metabólicos (producción de las sustancias liquénicas secundarias). El experimento BIOPAN mostró que Rusavskia elegans (Enlace) SY Kondr. & Kärnefelt (2003), Rhizocarpon Geographicum (L.) DC. lama. y Circinaria fruticulosa (Eversm.) Sohrabi (2012) sobrevivieron entre 10 y 14 días en el espacio, siendo metabólicamente activas y capaces de crecer después de la exposición8,12,13,14,15,16,17. El experimento LIFE tenía como objetivo exponer durante un año y medio diferentes muestras biológicas en el espacio. Rusavskia elegans mostró una alta recuperación en las mediciones de eficiencia fotosintética posteriores al vuelo en comparación con las otras especies probadas18.

Por otro lado, los experimentos en tierra nos permiten simular condiciones extremas y monitorear los parámetros de viabilidad de los organismos in situ o inmediatamente después del tratamiento3,6. Pleopsidium chlorophanum (Wahlenb.) Zopf se probó en condiciones de nicho en Marte en las instalaciones de simulación de Marte del Centro Aeroespacial Alemán (DLR Berlín, Alemania)20. Los resultados confirmaron la capacidad del liquen para adaptarse fisiológicamente y aumentar la fotosíntesis durante los 34 días de exposición a las condiciones del nicho de Marte. En cambio, C. fruticulosa estuvo expuesta fisiológicamente activa tanto en el nicho de Marte como en condiciones similares a la superficie durante 30 días en el Mars Simulation Facility también19 y solo las muestras de nicho mostraron respuestas de viabilidad. Para investigar los efectos peligrosos de la radiación ionizante en los líquenes, se irradiaron talos de R. elegans desecados en el Instituto Nacional de Ciencias Radiológicas (NIRS) en Chiba, Japón21. Los resultados revelaron una disminución significativa de la fotoeficiencia pero no correlacionada con las dosis crecientes aplicadas, lo que sugiere la alta capacidad de supervivencia de los talos anhidrobióticos.

En este estudio, la especie de liquen Xanthoria parietina (L.) Th. Padre estuvo expuesto a condiciones simuladas similares a las de Marte durante 30 días en el LABORATORIO DE SIMULACIÓN ANÁLOGA PLANETARIA (PASLAB) en el DLR en Berlín. La especie es un liquen foliáceo muy extendido que crece sobre cortezas y rocas y coloniza casi todos los hábitats desde la orilla del mar hasta la línea de árboles22. Crece también en ambientes comunes y antropizados, siendo tolerante a contaminantes del aire23 como NOX y metales pesados24. Xanthoria parietina fue elegida para este experimento debido a su tolerancia a la radiación UV debido a la sustancia del liquen parietina que protege la capa de fotobiontes (compañero de algas en la simbiosis del liquen) además del mucílago del micobionte y la matriz de hifas. Además, la parietina protege el aparato del fotosistema de las algas del alto flujo de luz25 y su producción es estimulada por la radiación UVB26,27. Específicamente, X. parietina ya ha sido expuesta a condiciones espaciales simuladas (hasta 16 h de vacío espacial a 10−3 Pa y rango de radiación UV de 160 a 400 nm) junto con Gyalolechia bracteata (Hoffm.) A. Massal., R elegans (un liquen productor de parietina presente en las rocas expuestas a la luz del sol sobre la línea de árboles) en las instalaciones de simulación espacial y planetaria (DLR, Köln, Alemania)6. Después de la exposición, la tasa de germinación de las ascosporas en el suelo análogo a Marte fue tan alta como en los otros medios minerales. Las ascosporas de Rusavskia elegans mostraron la mayor capacidad de supervivencia y X. parietina también mostró una notable tasa de germinación de las ascosporas irradiadas. En INAF—Observatorio Astrofísico de Arcetri (Florencia), X. parietina estuvo expuesta en dos condiciones extremadamente deshidratantes: radiación UV en atmósfera de N2 y radiación UV en vacío 100–10−2 Pa (dosis final ambas de 1,34 MJ m−2) y por primera vez, se realizaron análisis espectroscópicos IR in situ en las especies de líquenes expuestas28. La capacidad de recuperación se evaluó evaluando la fluorescencia de la clorofila a (Chl a), mostrando una recuperación completa en los talos expuestos al N2 y una recuperación del 50 % en las muestras expuestas al vacío, después de 72 h del tratamiento28. Como X. parietina pudo sobrevivir en estas condiciones, se consideró un candidato óptimo para futuras evaluaciones sobre su capacidad de supervivencia en condiciones extremas. Específicamente, expusimos por primera vez a X. parietina en condiciones simuladas de Marte, caracterizadas por una atmósfera con un 95 % de CO2 a 600 Pa, con un ciclo día-noche de humedad relativa (0,1–100 %) y temperatura (16–55 °C). ), y la radiación UV.

Nuestros objetivos fueron investigar la supervivencia de X. parietina en las condiciones mencionadas y estudiar su capacidad de recuperación, realizando por primera vez un enfoque multianálisis con un protocolo antes-después-control-impacto. Los propósitos principales del estudio fueron (i) evaluar in situ la fluorescencia de Chl a como un indicador de la reacción de luz activa de la fotosíntesis, a través del monitoreo en tiempo real de la viabilidad de los líquenes durante la exposición a condiciones similares a las de Marte y después de ellas durante la recuperación. período; (ii) evaluar cambios significativos en las características de los picos de los carotenoides en los espectros Raman de las muestras y (iii) identificar eventuales cambios ultraestructurales en las células de las algas mediante microscopía electrónica de transmisión.

Se recolectaron aleatoriamente doce talos de X. parietina en un área remota de la provincia de Florencia (Toscana, Italia 43°59′25.09″ N 11°13′24.65″ E, a unos 300 m snm) en agosto de 2021. Los especímenes se deshidrataron para 24 h a temperatura ambiente (25 °C) y almacenada a -18 °C hasta el tratamiento, ya que este procedimiento asegura que los talos se mantengan sanos para posteriores experimentos y análisis fisiológicos29. Tres días antes de los análisis previos a la exposición, se permitió que los especímenes recuperaran lentamente sus condiciones metabólicas normales en una cámara de crecimiento a 25 °C, con 12 h de oscuridad y 12 h de luz a 50 μmol m-2 s-1 de fotones PAR, rociados diariamente con agua destilada28,30,31. Al tercer día se realizaron mediciones de fotoeficiencia para evaluar la reactivación adecuada de los talos. Se deshidrataron durante 24 h y se cortaron para obtener 12 muestras de 1 cm2 de tamaño para los siguientes análisis28. El tamaño fue determinado por los portamuestras de aluminio adoptados para la exposición (Fig. 1a).

A la izquierda (a), muestras de X. parietina utilizadas en este experimento antes de los 30 días de exposición. Primera fila: muestras de Full Mars (FM); segunda fila: muestras de Dark Mars (DM); tercera fila: muestras de control externo (EC). A la derecha, PASLAB en Berlín DLR. (b) Cámara climática abierta y cámara experimental abierta. ( c ) Detalle de la cámara de experimento abierta con los portamuestras en el plato giratorio. ( d ) Detalle de la posición de muestra 1 con la fibra óptica Mini PAM anterior.

El experimento se llevó a cabo en el PASLAB del DLR de Berlín (Figs. 1, 2). El enfoque principal de PASLAB es Mars Simulation Facility32, que emplea una cámara climática ACS Discovery My DM340(C) (ATT Umweltsimulation GmbH) con un rango de temperatura de 180 a −75 °C. Las dimensiones internas de la cámara climática son de 601 mm de ancho, 810 mm de profundidad y 694 mm de altura (Fig. 1b). El experimento se realizó en un recipiente de acero inoxidable sellado al vacío con un volumen de 10,3 L, un diámetro interior de 20 cm y una altura de 32 cm (Fig. 1c). La cámara experimental cuenta con conectores eléctricos, conectores de entrada/salida de gas, cuatro fibras ópticas para luz UV y una fibra para mediciones de actividad fotosintética obtenidas con un analizador de rendimiento de fotosíntesis (Mini PAM, Walz GmbH, Alemania)32. La fuente UV es una lámpara de xenón de 150 W interconectada con las cuatro fibras. La luz se enfoca utilizando lentes ajustables en cuatro puntos de muestra (Fig. 2). La dosis de radiación de la luz Xe-UV se mide con un optómetro X92 y una sonda RCH-106-4 (Gigahertz-Optik GmbH, Alemania) en longitudes de onda que van de 250 a 400 nm19. Dentro de la cámara hay una plataforma giratoria con ocho portamuestras de aluminio, cuatro de ellos irradiados con UV y cuatro en condiciones de oscuridad19,32 (Figs. 1d, 2b). La fibra óptica Mini PAM se encuentra en la primera posición de muestra (Fig. 2b). Además, la cámara de experimentación está equipada con dos sensores SHT75 (Sensirion AG, Suiza) integrados con dos sensores de temperatura Pt-100 para medir la humedad y la temperatura cerca del plato giratorio. Los sensores de humedad han sido calibrados para la atmósfera marciana32. El flujo de gas a través de la cámara de experimentación es generado por un sistema de mezcla de gases, que puede controlar hasta cinco gases y permite un control preciso de la humedad del gas a través de un sistema de humidificación de CO2 (Fig. 2a). La presión interior está controlada por una bomba de vacío de membrana (MV10Vario, Vacuubrand GmbH)32. El control de todo el sistema se basa en un dispositivo de sistema DAQ (National Instruments Corp., EE. UU.) y el software Labview. La figura 2 muestra un esquema de todo el sistema.

(a) Configuración experimental de la instalación PASLAB. (b) A la izquierda, disposición del experimento dentro de la cámara del experimento, que muestra fibras ópticas de lámpara UV Xe y conexiones de fibra de luz Mini PAM. También se muestran las conexiones de gas. A la derecha, arriba de la vista en la plataforma giratoria con los ocho portamuestras.

El PASLAB es parte del Departamento de Laboratorios Planetarios y la instalación se utiliza para realizar experimentos de laboratorio con variación temporal controlada (por ejemplo, variaciones diurnas simuladas) de temperatura y humedad. La presión atmosférica y la composición se pueden configurar para simular condiciones similares a las de Marte. En particular, la cámara climática se puede ajustar a las condiciones termofísicas típicas de las latitudes medias/bajas marcianas20. Durante una ejecución experimental completa, la cámara de experimentación tenía un flujo de gas continuo de 20 lh−1 (a presión atmosférica). La mezcla de gas seco contenía 95 % de CO2 y 5 % de aire (4 % de N2 y 1 % de O2). La presión dentro de la cámara experimental fue de aproximadamente 600 Pa, la temperatura varió diurnamente entre 16 (día) y −55 °C (noche), mientras que la humedad relativa (respecto al hielo) osciló entre aproximadamente 0,1% (día) y 100%. (noche). Las condiciones experimentales se resumen en la Tabla 1 y la Fig. 3. La humedad del flujo de gas fue de aproximadamente − 2,8 ± 0,2 °C de temperatura del punto de congelación (tau/punto de congelación, Fig. 3) a 101 325 Pa durante todo el experimento, lo que corresponde a −52,6 °C a 600 Pa20.

Una instancia durante tres días del perfil de temperatura (línea roja) y humedad relativa (línea azul) del ciclo diurno similar a Marte. La línea cian indica la temperatura del punto de congelación.

Cuatro muestras de X. parietina fueron iluminadas por la lámpara Xe-UV en la posición de muestra (sp) 3, 4, 5, 6 y cuatro muestras se mantuvieron en la oscuridad dentro de la cámara de experimentación, expuestas a las condiciones atmosféricas en el sp 1, 2 , 7, 8 (Fig. 2b). La lámpara Xe-UV simula el espectro solar marciano completo con un rango espectral de 200 a 2200 nm en un punto de 13 mm de diámetro (Tabla 1). Se puede ver una comparación con el espectro del Sol en Marte en de Vera et al.20 y Schuerger et al.33. La lámpara UV estuvo activa durante 16 horas y se apagó durante 8 horas diarias para simular el ciclo diurno del Sol de verano en las latitudes medias. La lámpara UV se enciende y se apaga automáticamente. Se utilizó un Optómetro X92 con un cabezal RCH-106-4 para medir los flujos y las dosis de UV en longitudes de onda que oscilan entre 250 y 400 nm. Los valores de irradiancia UV medidos para las posiciones de la muestra irradiada fueron 15,8 W m−2 (sp3), 12,7 W m−2 (sp4), 14,2 W m−2 (sp5) y 14,0 W m−2 (sp6), con un promedio valor de 14,2 W m−2 comparable a los elaborados por Cockell et al.34, ca. 17 W m−2, y Gómez-Elvira et al.35, 7–8 W m−2 para la superficie de Marte en función de la latitud. Además, se realizaron simulaciones más cortas como estudios piloto para la exposición de 30 días.

Se han preparado doce muestras (de 1 cm2 de superficie cada una) a partir de talos de liquen recogidos y reactivados para la fase de análisis previa a la exposición. Los análisis de preexposición consistieron en espectroscopía Raman y análisis de fluorescencia de clorofila. Después de 24 h, la fotoeficiencia previa a la exposición se midió con un Imaging PAM (Walz GmbH, Alemania). A continuación, se expusieron cuatro muestras a la atmósfera simulada de Marte y se irradiaron con la lámpara Xe-UV (rango espectral 200–2200 nm, 16 h de luz/8 h de oscuridad) (FM, muestras de Full Mars colocadas en sp3, sp4, sp5 y sp6) , cuatro muestras se expusieron a la atmósfera simulada de Marte y se mantuvieron en la oscuridad (DM, muestras de Dark Mars posicionadas en sp1, sp2, sp7 y sp8) y cuatro muestras se mantuvieron en la cámara de crecimiento a 25 °C, con 12 h de oscuridad y 12 h de oscuridad. h luz a 50 μmol m-2 s-1 fotones PAR, mojada diariamente como controles externos28,31. Durante la simulación, la actividad fotosintética de las muestras de FM y DM se midió cada hora con un Mini PAM, gracias al carrusel de muestras de la cámara de experimentación (Fig. 2b). Simultáneamente, las condiciones termofísicas dentro de la cámara de experimentación fueron monitoreadas con un programa Labview. La simulación duró 30 días. Después de la exposición, las muestras no se rehidrataron inmediatamente, sino que se congelaron para los análisis posteriores a la exposición del día siguiente, con el fin de evitar una posible reactivación del liquen. Se cortaron pequeños segmentos de las muestras (FM, DM y controles externos) para la espectroscopia Raman como se hizo anteriormente para la fase de preexposición. Se recuperaron más segmentos de las muestras de FM, DM y controles externos y se almacenaron en un congelador a -18 °C para microscopía electrónica de transmisión, que se llevó a cabo más tarde en el Laboratorio de Biomorfología de la Universidad de Florencia, Italia. Los análisis posteriores a la exposición consistieron en la espectroscopia Raman, luego de lo cual las muestras de FM y DM se rehidrataron para la fase de recuperación. Durante esta última fase, las muestras de FM, DM y control externo se mantuvieron en la cámara de crecimiento a 25 °C, con 12 h de oscuridad y 12 h de luz a 50 μmol m−2 s−1 de fotones PAR, mojadas diariamente durante 8 días28, 31 Todos los días de la fase de recuperación, con excepción del fin de semana, las muestras de FM, DM y control externo se midieron con Imaging PAM para evaluar la actividad fotosintética y verificar su recuperación a lo largo del tiempo. En general, las mediciones de eficiencia fotosintética realizadas en diferentes momentos fueron: antes del tratamiento (pre_exp), después del tratamiento (post_exp) y 24 h (1 día), 48 h (2 días), 72 h (3 días), 96 h (4 días), 168 h (7 días) y 192 h (8 días) después del inicio de la fase de recuperación.

La actividad fotosintética del fotobionte del liquen se infirió de la fluorescencia de Chl a como indicador de la eficiencia del fotosistema II (PSII)13,19,20,28. La fluorescencia de Chl a se midió durante la simulación de 30 días cada hora a través de un instrumento Mini PAM (Mini PAM modelo II interconectado con la instalación PASLAB) (Fig. 2a). La fibra de luz Mini PAM estaba a ~ 1,5 cm de distancia de la muestra. Las mediciones de fluorescencia se expresaron como rendimiento cuántico PSII (Y), a través de las siguientes ecuaciones: (i) para líquenes adaptados a la luz como Y(II) = (FM′ − F)/FM′43 y (ii) para líquenes adaptados a la oscuridad como FV/FM = (FM − F0)/FM44, donde F (líquenes adaptados a la luz) y FV (líquenes adaptados a la oscuridad) son los valores de fluorescencia natural de las muestras medidas brevemente antes de la activación del pulso de saturación Mini PAM20. FM es la fluorescencia máxima medida después de la adaptación a la oscuridad y F0 es el rendimiento mínimo de fluorescencia44. FM′ es la fluorescencia máxima alcanzada durante el pulso de saturación, medida en condiciones de luz cuando todos los centros de reacción del PSII están abiertos. El rendimiento cuántico efectivo de PSII Y(II) se obtiene a partir de la relación de intensidades de fluorescencia como se describe en (i). En su lugar, el rendimiento cuántico FV/FM máximo de PSII se obtiene como se describe en (ii). Cualquier falta de homogeneidad de la intensidad de excitación de la fluorescencia puede interpretarse en términos de diferencias en la actividad fotosintética45. El Mini PAM, de acuerdo con las condiciones de luz/oscuridad, calculó la tasa efectiva de conversión de energía fotoquímica, que se muestra en el Mini PAM como el valor de rendimiento. Las muestras se expusieron a una luz intermitente durante 1 s con un pulso de excitación de luz roja (650 nm).

Se utilizó un PAM de imágenes para evaluar la fotoeficiencia del fotobionte antes, después y en los siguientes 8 días después de la exposición. El Imaging PAM estaba equipado con un mini cabezal de medición conectado a una cámara IMAG-K5 (apertura f.2, 640 × 480 píxeles, 96 ppp). El Mini Head está equipado con una plataforma de matriz de LED con doce lámparas LED de alta potencia, cada una equipada con óptica de colimación, que se organizaron en cuatro grupos de tres LED. Los LED de luz roja (IMAG-MIN/R 650 nm, con un pico de emisión a 620 nm) proporcionaron la luz de excitación del pulso de saturación. La plataforma de matriz de LED se montó a una distancia de trabajo de 7 cm por encima de las muestras. El Imaging PAM recuperó las imágenes de las muestras a través de los valores promedio de fluorescencia FV/FM del área seleccionada en la muestra. Las mediciones de fluorescencia se realizaron en condiciones adaptadas a la oscuridad. Las muestras de líquenes se hidrataron y se adaptaron a la oscuridad (cubriendo la placa de Petri con un paño negro) durante 10 minutos antes de las mediciones de Imaging PAM28,31.

Las mediciones Raman se realizaron con un microscopio confocal Raman WITec Alpha300 Raman System (Oxford Instruments, Reino Unido) a temperatura ambiente y condiciones atmosféricas ambientales. La longitud de onda de excitación del láser Raman fue de 532 nm, una resolución espectral de 4–5 cm−1 y una rejilla de 600 l/mm. Se utilizó un objetivo Nikon 10 × con una apertura numérica de 0,25 para enfocar el láser en un punto de 1,5 μm. La potencia del láser de superficie se fijó en 1 mW. Se realizó una calibración espectral con una muestra de prueba de silicio puro46. Con el fin de evitar posibles daños a la muestra por la espectroscopia Raman, se cortó a propósito un pequeño segmento de cada una de las muestras. Para cada segmento (4 Full Mars y 4 Dark Mars, antes/después de la exposición) se identificaron 4 puntos. En cada punto, se recuperó un escaneo lineal (transecto) con un tiempo de adquisición de 1 s para una acumulación de 1 × en 50 puntos (50 espectros), obteniendo 200 espectros por muestra. La configuración de adquisición se eligió para evitar la saturación de la señal de la fluorescencia de los pigmentos fotosintéticos, específicamente la clorofila. De hecho, se realizaron mediciones Raman para identificar cambios en las características de los picos de carotenoides. El β-caroteno y las xantofilas son las principales moléculas responsables de la señal Raman de los carotenoides y la señal Raman típica esperada constaba de tres picos carotenoides principales46. Dos picos fuertes a 1515 cm−1 y 1150 cm−1, característicos de las vibraciones en fase C = C (ν1) y estiramiento C–C (ν2) de la cadena de polieno en los carotenoides. Además, los modos oscilantes en el plano de CH3, grupos unidos a la cadena de polieno acoplados con enlaces C-C, ocurrieron en la región de 1000 cm−146,47.

Procedimos evaluando (i) los valores de la relación señal/ruido (SNR) de los espectros recuperados, y (ii) la diferencia antes/después de la exposición de las características de los picos de los carotenoides para comparar los efectos de las condiciones similares a las de Marte en los expuestos. muestras La SNR para los picos de carotenoides en los espectros se definió como la altura (Amp) del pico de 1515 cm−1 dividida por el ruido representado como la desviación estándar de la región espectral cerca de los picos Raman (700–900 cm−1)46. Los espectros acumulados se dividieron en tres clases diferentes47. Los espectros de clase 1 muestran una fuerte SNR con los tres picos característicos dominando los espectros (SNR > 20). Los espectros de clase 2 tienen una SNR media/baja con un desvanecimiento máximo de 1000 cm−1 (5 < SNR < 20). Los espectros de clase 3 se clasifican por picos nulos/no detectables (SNR < 5)47. Las características de los picos de los espectros de las muestras de FM y los espectros de las muestras de DM (la altura o la amplitud (Amp), el ancho a la mitad de la altura (w) y la posición del pico en el número de onda (x)) se recuperaron de los espectros de clase 1 (SNR > 20) ajustando el espectro promediado resultante usando una función de Lorentz46. El ajuste lorentziano se realizó en el software Project FIVE 5.0 (WITec Suite FIVE).

La microscopía electrónica de transmisión se llevó a cabo en el Laboratorio de Biomorfología de la Universidad de Florencia, Departamento de Biología. Después de la exposición, se cortaron pequeños segmentos de las muestras expuestas y luego se sellaron en tubos Eppendorf y se almacenaron en el congelador a -18 °C hasta los análisis microscópicos. Los segmentos tenían que ser fijados, deshidratados, incrustados en resina y teñidos para las observaciones TEM48. Se utilizaron procesos de fijación e inclusión para evitar la descomposición de los segmentos y preservar sus propiedades químicas y físicas. Los segmentos se fijaron en glutaraldehído (C5H8O4) al 2,5 % en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,2) durante 4 h. Luego, se sometieron a un lavado de 12 h en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,2). El tercer paso implicó la fijación en tetróxido de osmio al 1% (Os4O) en el mismo tampón durante 90 min y luego un lavado de 20 min en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,2)49. El tampón fosfato sirvió para transportar el fijador, para evitar modificaciones de pH, osmolaridad y composición iónica. A continuación, los segmentos se deshidrataron gradualmente con etanol para prepararlos para su inclusión. La incrustación de la resina permitió obtener un material duro que puede ser finamente seccionado. Después de un último paso en óxido de propileno, se introdujo gradualmente la resina epoxi Spurr50 en los segmentos. En el primer paso, se preincluyeron en óxido de propileno y Spurr en proporción 1:1 durante 1 h. Luego se duplicó la cantidad de resina hasta una proporción de solvente y Spurr de 1:2 por 1 h. En el tercer paso, los segmentos se trataron con resina pura en estufa a 45 °C por 1 h y al final se incluyeron en la caja de empotrar HistoMold a 70 °C en estufa por 12 h. Los segmentos incluidos se cortaron con un Ultramicrótomo Reichert Jung Ultracut E (Leica Biosystems GmbH, Alemania), obteniendo secciones con un espesor entre 50 y 100 nm utilizando cuchillas de diamante y vidrio. Las secciones se colocaron en la superficie de un recipiente con agua destilada y luego se transfirieron a una rejilla de cobre para las observaciones TEM. Algunas secciones se colocaron en un portaobjetos y se tiñeron con azul de toluidina al 0,1 % y carbonato de sodio diluido al 0,1 % en H2O, luego se observaron bajo el microscopio de luz con transmisor óptico LEICA LEITZ DM-RB FLUO (Leica Biosystems GmbH, Alemania). Las observaciones TEM se realizaron con un microscopio electrónico de transmisión PHILIPS EM201 (Philips, Países Bajos)48.

Tanto para los análisis de fluorescencia de Chl a (Mini PAM, durante la exposición como para Imaging PAM, antes/después de la exposición más el período de recuperación), los datos se analizaron ajustando modelos lineales de efectos mixtos (LMM) en un diseño ANOVA de mediciones repetidas, utilizando la identidad de la muestra. como un factor aleatorio para dar cuenta de la correlación temporal de las observaciones. El tiempo se utilizó como variable ordinal porque la relación entre Y y el tiempo no era una regresión lineal simple. Se utilizó Y como variable de respuesta y las dos condiciones de tratamiento (FM y DM) y el tiempo de recuperación como variables explicativas en un diseño factorial completo. Se utilizó el método de prueba de chi-cuadrado de Wald ANOVA tipo II para verificar la importancia de los efectos fijos y de los factores de interacción asociados. La normalidad de los datos se comprobó con la prueba de Shapiro-Wilk. En particular, para los análisis Mini PAM, se realizó la prueba del coeficiente de correlación de Pearson para verificar la correlación lineal entre Y y los parámetros termofísicos de la cámara del experimento (T, P, hum y tau/punto de escarcha).

Los datos Raman se elaboraron recuperando los valores característicos de los picos de carotenoides (Amp, w y x) de los espectros SNR > 20 (ver párrafo "Espectroscopía Raman"). El conjunto de datos específico que consiste en los valores de la función antes/después se separó por tratamiento. Cada conjunto de datos se analizó con ANOVA unidireccional para verificar la eventual diferencia significativa entre los valores de las características de exposición antes y después. También se realizó la prueba t de dos muestras de Welch en los conjuntos de datos para la prueba de ANOVA unidireccional. Se realizó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, en lugar de ANOVA, cuando los valores característicos de los picos de carotenoides no se distribuyeron normalmente.

Todos los análisis se realizaron con el software de código abierto RStudio v. 1.4.1106. Los cálculos de ANOVA se realizaron utilizando la función Anova del paquete de automóvil versión 3.0-10 para la prueba de chi-cuadrado de Wald ANOVA tipo II y la función aov (en base R) para la prueba ANOVA unidireccional. Los cálculos de LMM se realizaron utilizando la función lmer del paquete lme4 versión 1.1-12 para ajustar los modelos.

Los resultados del análisis de fotoeficiencia in situ se muestran en la Fig. 4 con las correspondientes condiciones similares a las de Marte en la sección superior de la imagen. Los valores de irradiancia UV medidos para las muestras irradiadas fueron 15,8 W m−2 (sp3), 12,7 W m−2 (sp4), 14,2 W m−2 (sp5) y 14,0 W m−2 (sp6), con un valor medio de 14,2 W m−2. La dosis final absorbida acumulada de radiación UV fue de 24,5 MJ m−2. En la Fig. 4, después de las primeras 4 h, se observó una caída en los valores de rendimiento de FM y MS Y, de 54% y 42%, respectivamente. Después de eso, la actividad fotosintética no se mantuvo constante durante el experimento, siguiendo una tendencia cíclica de "arriba y abajo". En concreto, el Mini PAM midió los valores más altos de Y durante la noche (8 h de oscuridad), correspondientes a una humedad relativa máxima y una temperatura de −55 °C, y los valores más bajos de Y durante el día (16 h de luz para muestras de FM), correspondiente a una humedad relativa mínima y una temperatura de 16 °C. Los datos de la Tabla S1 confirman la diferencia significativa entre los valores de pico alto y bajo de Y durante el experimento y la diferencia significativa entre los dos tratamientos (FM y DM) (p < 0,001). La prueba de correlación de Pearson indicó una correlación significativa (p < 0,001) entre los valores de Y y la temperatura (R = − 0,62 FM, R = − 0,52 DM) y la humedad (R = 0,59 FM, R = 0,44 DM) (Fig. S1). Los valores de Y no mostraron una correlación altamente significativa con la presión (R = 0,23 p < 0,001 FM, R = 0,12 p < 0,05 DM) y tau/punto de escarcha (R = 0,14 p < 0,05 FM, R = 0,065 p = 0,1 DM) (Figura S1). Como se reporta en la Fig. 4, entre el 2° y 4° día y la 25° noche, la temperatura de punto de congelación alcanzó ~9.0 ± 0.2 °C debido a que la botella de gas CO2 estaba vacía y por lo tanto hubo que cambiarla. Dado que solo se insertó el flujo de gas de aire seco de 0,5 lh−1 en esos períodos de tiempo, los valores de humedad mostraron un aumento debido a que la bomba de vacío no estaba extrayendo la atmósfera de la cámara experimental (debido al menor flujo de gas de aire de entrada).

Arriba, temperatura (línea roja) y humedad (línea azul) ciclos día-noche realizados en el PASLAB en DLR Berlín. La franja azul claro/amarilla representa el fotoperíodo diurno y nocturno relacionado con el encendido/apagado de la lámpara UV. A continuación, la línea cian representa el punto de congelación de la humedad de la mezcla de gases. Las estrellas magenta representan los valores de rendimiento de las muestras de Full Mars FM y los puntos verdes representan los valores de rendimiento de las muestras de Dark Mars DM. Consulte la Tabla S1 para ver los resultados de ANOVA.

Los resultados de los análisis de fotoeficiencia de recuperación se muestran en la Fig. 5a y la Tabla S2. El rendimiento cuántico máximo de la fotoquímica primaria (Y = FV/FM) cambió significativamente después del tratamiento en ambas condiciones experimentales (Tabla S3, p < 0,001). Los valores de rendimiento (FV/FM) de las muestras de FM y DM mostraron una disminución significativa en comparación con los valores previos a la exposición. Los valores de DM alcanzaron el valor de caída desplegable de 0,339 ± 0,083 (media ± DE). En cambio, los valores de FM alcanzaron un valor inferior de 0,096 ± 0,042, cruzando el umbral de 0,200, que se considera el límite de fotoinhibición51. Una vez que comenzó el período de recuperación, los valores de FV/FM aumentaron significativamente dependiendo de los tratamientos. En 24 h, los valores de FM ya se recuperaron 0,418 ± 0,023 y los valores de DM alcanzaron 0,546 ± 0,122. Para ambos tratamientos, las muestras mostraron tendencias de recuperación similares, con valores de DM que alcanzaron el máximo en 0,634 ± 0,051 (después de 96 h). Sin embargo, luego de las 72 h de recuperación, los valores de FM no aumentaron más de 0.541 ± 0.007 (después de_192 h). En consecuencia, las muestras de FM no pudieron recuperar los valores iniciales de FV/FM. Las condiciones de recuperación fueron las mismas de las muestras de control (ver la sección "Materiales y Métodos"). Los valores de FV/FM de las muestras de control variaron entre 0,653 ± 0,020 (pre_exp) y 0,594 ± 0,040 (después de_192 h). Durante los fines de semana, las muestras en la cámara de crecimiento no se hidrataron (incluso los viernes, los talos se humedecieron constantemente) y probablemente por esta razón se observó una disminución de los valores de FV/FM de las muestras de control al final del período de recuperación. Las imágenes de FV/FM, informadas en la Fig. 5b, muestran la depresión de la fotoeficiencia de la muestra de FM del talo después del tratamiento (colores falsos amarillo-marrón) y, después de la reactivación, los colores falsos cambian de marrón a verde y verde oscuro, y nunca vuelven a alcanzar azul, durante las próximas 192 h52. Por el contrario, las imágenes de FV/FM de muestras de DM muestran un color falso verde/verde oscuro para post-exp. imágenes, recuperando después de eso el falso color azul.

(a) Variación de la eficiencia del PSII (Y = FV/FM) antes (pre_exp), después (post_exp) y 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 168 h y 192 h después del tratamiento. Línea azul = control externo, EC; línea magenta = Marte completo, FM; línea verde = Marte oscuro, DM. Las barras de error representan intervalos de confianza. Consulte la Tabla S3 para ver los resultados de ANOVA. (b) Imágenes de fluorescencia (FV/FM) de los tratamientos de tres muestras (Full Mars, Dark Mars y External Controls) antes (pre-exp.), después (post-exp.) y 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 168 h y 192 h después del tratamiento realizado con el instrumento Imaging PAM. Después de la simulación, se cortaron pequeños segmentos para observaciones TEM y espectroscopia Raman de muestras de Full Mars y Dark Mars. La leyenda del tamaño del material del liquen y los valores de la barra de color se informa en la parte inferior derecha de la imagen.

Los valores mínimos de rendimiento de fluorescencia F0 se informan en la Fig. S2 y la Tabla S4. Como se informa en la Tabla S5, no hay una diferencia significativa entre los tratamientos. Después de la exposición, los valores de FM y DM F0 alcanzaron 0,136 ± 0,054 y 0,124 ± 0,010, respectivamente. Para ambos tratamientos, las muestras mostraron una tendencia decreciente durante el período de recuperación, siendo las muestras de MS más rápidas en la caída (Fig. S2 y Tabla S4). Al final del período de recuperación, los valores de FM y DM F0 fueron 0,081 ± 0,024 y 0,083 ± 0,038, respectivamente. Los valores de F0 de las muestras de control oscilaron entre 0,122 ± 0,031 (después de 192 h) y 0,151 ± 0,021 (después de 24 h) durante el período de recuperación.

Además, realizamos simulaciones más cortas de diferentes duraciones. La simulación de 3 h tuvo como objetivo interceptar la curva decreciente de fluorescencia de Chl a (rendimiento) en la aplicación de condiciones similares a las de Marte para evaluar qué tan rápido disminuye la fotoeficiencia. La simulación de 7 días se realizó para evaluar eventuales cambios en la recuperación de la fotoeficiencia con las muestras de simulación de 30 días. Los resultados de simulación más cortos se informan en Materiales complementarios.

La figura 6 muestra la comparación entre los espectros antes/después de FM y DM Raman. Se midió con éxito un espectro típico de carotenoides, con los tres picos a 1000, 1150 y 1515 cm−1, para todas las muestras, pero con una clara disminución en las intensidades de los picos después de la exposición. Para comparar cuantitativamente los espectros según el tratamiento, consideramos la característica del pico Amp (amplitud, altura o intensidad del pico), w (FWHM, ancho completo a la mitad del máximo) y x (posición del pico en el número de onda) de espectros con SNR > 20 (ver la sección "Materiales y Métodos"). Se realizó una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis para todos los valores de posición (x) de los picos de carotenoides de FM y para los valores de posición (x) de DM 1515 cm−1 porque los datos no tenían una distribución normal. Las características de los picos de carotenoides promedio (Amp, w y x), antes y después de la exposición, se informan en las Tablas S6 y S7. La Figura S3 muestra las características del pico de 1000 cm−1 comparadas antes/después de la exposición para los tratamientos FM (a la izquierda) y DM (a la derecha). En las muestras de FM, las diferencias de Amp, w y x fueron significativas (p < 0,001, tablas S8 y S9). En las muestras de DM, las diferencias de w y x fueron significativas (p < 0,001, Tablas S8 y S9), pero la diferencia de Amp no lo fue (Tabla S8). La Fig. S4 muestra las características del pico de 1150 cm−1 (Amp, w y x) comparadas antes/después de la exposición para los tratamientos FM (a la izquierda) y DM (a la derecha). En las muestras de FM, las diferencias de Amp y x fueron significativas (p < 0,001, Tabla S8 y Tabla S9), pero la diferencia de w no fue muy significativa (p < 0,05, Tabla S8). En las muestras de DM, las diferencias de Amp (p < 0,1), w (p < 0,05) y x (p < 0,05) no fueron muy significativas (Tablas S8 y S9). La Fig. S5 muestra las características máximas de 1515 cm−1 (Amp, w y x) comparadas antes/después de la exposición para los tratamientos FM y DM. En las muestras de FM, las diferencias de Amp, w y x fueron significativas (p < 0,001, tablas S8 y S9). En las muestras de DM, la diferencia de Amp no fue muy significativa (p < 0,1, Tabla S8), la diferencia de w fue significativa (p < 0,001, Tabla S8) y la diferencia de x no fue significativa (Tabla S9).

Por encima de la comparación entre la media FM pre-exp. Espectros Raman (línea negra) y media FM post-exp. Espectros Raman (línea roja). A continuación) comparación entre la media de DM preexp. Espectros Raman (línea negra) y media DM post-exp. Espectros Raman (línea azul).

La caracterización ultraestructural de las muestras del Control Externo se basó en los trabajos de Hinojosa-Vidal et al.53, Meyer et al.54 y Molins et al.55. La Figura 7 muestra dos imágenes (Fig. 7e,f) de la muestra de control externo. En la Fig. 7e (barra de 2 µm de tamaño), está la célula fotobionte con membranas tilacoides visibles (Chl), que forman el típico cloroplasto en forma de estrella de Trebouxia sp., y pirenoide reconocible (Py) con pirenoglóbulos (Pg). También se indican la pared celular (CW), las vesículas periféricas (PV) y la zona de secreción (SZ). Las dos pequeñas células de fotobiontes en la parte superior de la imagen contienen gránulos de almidón (S). Los tres fotobiontes están rodeados de hifas (Hy). En la Fig. 7f (barra de tamaño de 2 µm), una célula de alga muestra un alto contenido de gránulos de almidón (S). Estos últimos están dispuestos en un patrón "en forma de estrella" como las membranas tilacoides, que no son visibles en la imagen. En el centro de la célula se reconocen una estructura pirenoidal (Py) y pirenoglóbulos (Pg).

Análisis ultraestructural TEM del fotobionte Trebouxia sp.; (a, b): Marte completo (FM); (c, d): Dark Mars (DM) y (e, f): Controles externos (EC). Cada imagen se informa con una barra de tamaño de referencia: (a) 1 µm; (b) 1 µm; (c) 2 µm; (d) 1 µm; (e) 2 µm; (f) 2 µm. Soporte de símbolo de abreviatura para Chl, cloroplasto; CW, pared celular; Hy, hifas; Pg, pirenoglobuli; Ph, fotobiontes; PV, vesículas periféricas; Py, pirenoide; S, gránulos de almidón; SZ, zona de secreción; T, túbulos y Th, tilacoides. Las flechas negras indican gotitas de lípidos densas en electrones.

La Figura 7 muestra dos imágenes (Fig. 7a, b) de las muestras de FM y dos imágenes (Fig. 7c, d) de las muestras de DM después de la simulación de 30 días. La figura 7a (barra de 1 µm de tamaño) muestra una desorganización general en las membranas de los tilacoides (Th), mientras que los cloroplastos (Chl) ya no muestran la forma típica de "estrella". Las células de algas muestran un menor número de gránulos de almidón (S), pocas y más grandes vesículas periféricas (PV) (como también observaron Molins et al.55) y menos pirenoglóbulos en el medio (Pg). Las flechas negras indican supuestas gotitas de lípidos densas en electrones8,56,57,58. La Figura 7b (barra de 1 µm de tamaño) muestra claramente la desorganización del cloroplasto (Chl) y las membranas de los tilacoides relacionados (Th), menos pirenoglóbulos (Pg) en el medio, menos gránulos de almidón (S) y vesículas periféricas más grandes (PV). Las flechas negras indican gotitas de lípidos densas en electrones. La Figura 7c (barra de 2 µm de tamaño) muestra la capa superior de la corteza, con la sección de hifas (Hy), y la capa gonidial con fotobiontes (Ph), que parece estar comprimida. La figura 7d (barra de 1 µm de tamaño) muestra una célula fotobionte rodeada de hifas (Hy). En las muestras de DM, la ultraestructura del fotobionte es más similar a las muestras de control que en las muestras de FM. El cloroplasto "en forma de estrella" (Chl), con los gránulos de almidón (S) siguiendo la forma de las membranas de los tilacoides, y el pirenoide (Py) en el medio con los pirenoglóbulos (Pg) unidos entre sí a través de los túbulos blancos (T ), son claramente distinguibles. Los pirenoides parecen menos densos en contenido de pirenoglóbulos que las muestras de control.

La especie de liquen Xanthoria parietina pudo sobrevivir a las condiciones similares a las de Marte simuladas en PASLAB durante 30 días. La naturaleza de la relación metabólica de simbiosis, las características de poiquilohidria y anhidrobiosis pueden haber contribuido a la supervivencia del liquen en condiciones similares a las de Marte. Los dos tratamientos simulados (FM y DM) afectaron de forma diferente a las muestras de líquenes, mostrando notables diferencias en los parámetros fotosintéticos, tanto in situ como durante la recuperación. En las primeras horas de la simulación de 30 días, las muestras de FM y DM mostraron una caída en los valores de Rendimiento, que los líquenes superaron en menos de ~ 12 h 20. La exposición de muestras de FM a una dosis de 24,5 MJ m−2 puede haber provocado una disminución del rendimiento máximo y mínimo de FM de la fluctuación cíclica (en comparación con las muestras de DM), alcanzando valores mínimos cercanos a ~ 0,200, que se considera el límite de fotoinhibición51. La fluctuación periódica muestra una fuerte correlación con los ciclos de temperatura y humedad (Fig. S1). Los valores de rendimiento de fluorescencia de Chl a dependen en gran medida del contenido de agua del liquen y, en consecuencia, de la disponibilidad de agua en el entorno circundante debido a su poiquilohidratación52,59,60,61. Además, la actividad de PSII es un requisito previo para la adquisición de energía por fotólisis del agua7. Dado que la humedad relativa alcanzó su máximo durante la noche, el rendimiento de fluorescencia de Chl a (para ambos tratamientos) también alcanzó su máximo durante la noche. La fluctuación cíclica del Yield sugiere una mayor fotoeficiencia en la noche, ligada al 100% de humedad relativa, y casi fotoinhibición durante el día, especialmente para los valores de FM cuando la humedad relativa fue del 0,1%. Dado que las muestras de DM mostraron la misma fluctuación periódica de las muestras de FM, excluimos que la fluctuación día-noche pudiera estar relacionada con la adaptación luz/oscuridad. El impulso del fluorímetro permitió que ocurriera la reacción ya que la fotosíntesis depende de la luz, incluso durante la simulación nocturna20. Esto significa que la medición del valor de rendimiento se debe a la hidrólisis dependiente de la luz y al reemplazo de electrones en las moléculas de clorofila. En consecuencia, si hay humedad disponible, la reacción de la luz podría funcionar en Marte y debería funcionar específicamente en períodos de luz solar atenuada (primera hora de la mañana y última de la noche), ya que, incluso en la Tierra, la luz solar plena inhibe la fotosíntesis óptima en algas y cianobacterias20.

La radiación UV más la aplicación de vacío/baja presión demostraron tener un mayor impacto en el rendimiento fotosintético de los líquenes6,13,28. Los valores óptimos de rendimiento no se ven afectados directamente por la baja presión y la alta concentración de CO23. A pesar de esto, los líquenes expresan valores de rendimiento altos en general (casi siempre por encima de ~ 0,200) cuando se exponen a niveles porcentuales de CO2 más altos mantenidos en una atmósfera similar a la de Marte a baja presión (600 Pa). Por lo tanto, los altos valores de rendimiento durante la exposición pueden estar relacionados con la baja disponibilidad de CO2 presurizado y también con los ciclos diurnos de humedad. Además, la alta disponibilidad de CO2 podría representar una ventaja para la fotosíntesis, lo que sugiere la posibilidad de que el micobionte constituya una posible fuente de carbono a través de la respiración o del almacenamiento de CO2 con el alga, liberando CO2 y absorbiendo O2 de la fotosíntesis3.

Después del período de tiempo de recuperación, los valores de FM FV/FM no alcanzaron los valores iniciales, como se investigó previamente en Lorenz et al.28. Por otro lado, DM FV/FM post-exp. los valores disminuyeron un 46%, recuperando casi el 97% de la pre-exp. valores en 48 h (Fig. 5a), lo que sugiere efectos de fotoinhibición nulos o menores en comparación con las muestras de FM. Las imágenes de FV/FM (Fig. 5b) destacaron que los lóbulos externos y específicamente los márgenes de los lóbulos, que representan las partes más jóvenes del talo62, se recuperaron primero en ambos tratamientos. Los valores de F0, que indican la apertura de los centros de reacción del PSII en la oscuridad63, muestran una tendencia decreciente a lo largo del tiempo durante el período de recuperación para ambos tratamientos sin diferencias significativas (Fig. S2; Tabla S5). F0 depende del contenido de clorofila del complejo captador de luz64 y, en consecuencia, de la estructura de los complejos de antena65. En vista de esto, las tendencias de F0 después del tratamiento (Fig. S2) pueden indicar daños relacionados con los mecanismos de apertura/cierre de los centros de reacción del PSII28, incluso si los tratamientos no resultaron significativamente diferentes (Tabla S5).

Además, la duración del experimento puede afectar la FV/FM post-exp. valores y velocidad de recuperación con posibles efectos como fotoinhibición del PSII y retraso en la reactivación de la fotosíntesis66. Los valores de FV/FM alcanzados al final del período de recuperación sugieren que los daños estructurales del PSII o la clorofila pueden ser similares en las muestras expuestas a la radiación UV durante diferentes períodos de tiempo (ver Materiales complementarios).

La matriz de hifas con la estructura del talo y las sustancias del liquen pueden estar involucradas en la supervivencia del liquen. La sustancia del liquen secundario parietina, depositada en la corteza superior del talo, es conocida por sus propiedades de detección de luz azul, UVB y UVC67, que se produce de manera más eficiente en anhidrobiosis o estado desecado27,67 debido al mejor mecanismo de disipación térmica de la energía de la luz68. Los carotenoides también pueden haber jugado un papel crucial en la fotoprotección del fotobionte. Estas sustancias cumplen dos funciones importantes, (i) la fotoprotección de los centros de reacción frente a altas intensidades de luz que involucran procesos NPQ69,70 y (ii) la eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS) gracias a sus características antioxidantes71,72,73,74. Las condiciones simuladas pueden haber producido daños directos y/o indirectos por interacción en las células de los fotobiontes75. Estos daños abarcan los fotosistemas, la fotodisociación/fotoexcitación de proteínas y ácidos nucleicos76 y/o la formación de ROS, involucrando la peroxidación de lípidos, la oxidación de aminoácidos y la alteración de las actividades de las enzimas66,77. Los carotenoides extintores de ROS (como el β-caroteno) y las xantofilas, que previenen la formación de ROS a través del ciclo de la xantofila, se pueden consumir para prevenir los efectos dañinos de las ROS o se pueden fotodegradar por la radiación UV76. Además, los carotenoides representan un biomarcador crucial en astrobiología debido a sus características relacionadas con la fotoprotección y su alta conservación bajo radiación ionizante cuando se incorporan en simuladores del suelo marciano46,47.

Se identificaron variaciones significativas en las características máximas de los carotenoides de la muestra de FM y las muestras de DM no mostraron cambios significativos en la característica Amp de los picos de los carotenoides. Dado que los métodos cuantitativos Raman se basan con frecuencia en el área de la banda o en la altura de la banda (Amp)78,79,80,81, podemos suponer que la disminución de la característica Amp puede estar relacionada con el consumo de carotenoides y con la reducción de la concentración de carotenoides en las muestras de FM. Por otro lado, la posición de la banda Raman (x) o el ancho (w) se utilizan con mayor frecuencia para los análisis cuantitativos de analitos relacionados con la composición, como la cristalinidad, el estrés o la temperatura78,82. En concreto, la posición de la banda Raman depende de las masas atómicas y de la fuerza del enlace químico que las une. El orden molecular local, las fuerzas externas, la hidratación, la temperatura y las radiaciones pueden afectar la fuerza del enlace químico78,83,84. Los cambios en las características de los amplificadores están relacionados principalmente con los procesos de fotodegradación provocados por la radiación UV. Por otro lado, los cambios en las características de w y x también pueden estar relacionados con las condiciones atmosféricas, como los ciclos de temperatura y humedad78,83,84, ya que las muestras de ambos tratamientos parecen verse afectadas. Nuevamente, las muestras de FM aún muestran diferencias de mayor importancia que indican un mayor efecto de la fotodegradación sobre las condiciones ambientales. Estos resultados concuerdan con los análisis de recuperación de fluorescencia de Chl a, donde las muestras de FM no alcanzaron los valores iniciales durante el tiempo de recuperación. Esto sugiere efectos más fuertes y dañinos por las condiciones atmosféricas más la radiación UV y daños eventuales a los fotosistemas, lo que explica la disminución significativa de las alturas máximas de los carotenoides. Sin embargo, las muestras de FM aún resultaron fotosintéticamente activas en términos de fluorescencia de Chl a durante el período de recuperación, lo que demuestra que los líquenes poseen una estrategia fotoprotectora compleja para tener éxito en ambientes extremos84.

Uno de los factores clave de la supervivencia de los líquenes es la anhidrobiosis66, que produce alteraciones visibles y temporales de la ultraestructura celular85,86. Por lo tanto, se sabe que las células fotobiontes colapsan temporalmente al deshidratarse en condiciones terrestres85,86. Tras la rehidratación, los fotobiontes del liquen recuperan su forma esférica86. Por el contrario, los colapsos celulares permanentes indican un daño inducido por la desecación que puede conducir a la muerte después de varios años de deshidratación86,87. La desecación por vacío se considera el principal proceso que afecta a las muestras biológicas cuando se exponen a las condiciones espaciales, mientras que presiones similares a las de Marte producen menos efectos relacionados con la desecación86. Nuestras muestras no mostraron ninguna alteración de forma relevante ni colapso del protoplasto debido a la exposición a condiciones de baja presión. Los fotobiontes de las muestras de MS no presentaron cambios significativos, excepto por una disminución en el número de pirenoglóbulos relacionados con los procesos de deshidratación/rehidratación88. La función de estas estructuras puede ser la de un reservorio de pigmentos lipófilos, utilizados en caso de necesidad. Las diferencias más significativas se observaron entre las muestras de control y las muestras FM. Dado que se observaron varias vesículas periféricas en las muestras de control, suponemos que los cuerpos blancos grandes representan vacuolas vacías (debido al color claro) o vesículas periféricas agrandadas que posiblemente indican estrés celular8,55. Las muestras de DM parecen conservar pequeñas y numerosas vesículas periféricas. Varios cuerpos oscuros se notaron solo en muestras de FM. Estos cuerpos electrondensos posiblemente podrían representar acumulaciones de lípidos56,57,58 como consecuencia de la pérdida de lípidos por la degradación de las membranas celulares y tilacoides y la desaparición de los túbulos pirenoides8, indicando algún grado de senescencia88. El colapso de los túbulos podría deberse a la extracción de agua de la luz relacionada con las bajas presiones oa un cambio en la configuración de la estructura de la proteína pirenoide deshidratada89. Los fotobiontes exhiben una desorganización general del cloroplasto en términos de membranas tilacoides, que tienden a hincharse y enroscarse, y matriz pirenoide. Además de las condiciones termofísicas y de baja presión similares a las de Marte, el liquen tuvo que hacer frente a la radiación ultravioleta. A la luz de los análisis de fluorescencia de Chl a y los resultados de Raman, podemos confirmar que la radiación UV representó el factor más dañino8,13, lo que concuerda con los análisis ultraestructurales. A pesar de esto, parece que los cambios ultraestructurales fueron reversibles o, al menos, que la integridad celular fue lo suficientemente alta como para mantener una fotoeficiencia adecuada y un metabolismo funcional del liquen, como resultó del análisis de fluorescencia de Chl a. Trabajos previos mostraron que el daño ultraestructural en células de R. Geographicum y R. elegans no necesariamente indicaba una falla metabólica13. El intervalo de 100 a 200 nm de la longitud de onda de la radiación UV solar (vacío-ultravioleta) es la parte más dañina del espectro solar8,86 y dado que nuestras muestras estuvieron expuestas a un espectro de luz λ ≥ 200 nm (que representa las condiciones de la superficie de Marte), podemos suponer que no experimentaron el rango más nocivo de radiación solar.

Nuestros hallazgos mostraron por primera vez que X. parietina es capaz de sobrevivir en condiciones análogas a las encontradas en el cinturón ecuatorial marciano durante 30 días. Sin embargo, es necesario realizar más análisis para investigar las interacciones del talo del liquen con el suelo análogo de Marte y las exposiciones múltiples para evaluar la adaptabilidad de la fotosíntesis a las condiciones de Marte. Además, la fotodegradación de la parietina bajo la radiación ultravioleta podría investigarse más a fondo para comprender su fotoconservación. Dado que la reacción a la luz podría eventualmente ocurrir en Marte en presencia de agua, otros hábitats, como nichos, que están iluminados con luz atenuada / dispersa, pueden representar contextos más adecuados para organismos putativos similares a X. parietina. Por lo tanto, nuestros resultados remarcaron que los líquenes son organismos adecuados para experimentos en astrobiología. La adaptabilidad ecofisiológica de diferentes especies de líquenes en hábitats extremos es clave para entender su capacidad de supervivencia, incluso en el espacio y en entornos extraterrestres. Además, la evaluación de la capacidad de supervivencia de los líquenes en condiciones similares a las de Marte también puede brindarnos información sobre la posible preservación de biomarcadores complejos en la superficie de Marte, lo que plantea restricciones a la exploración de la superficie.

Los datos están disponibles bajo solicitud razonable al autor correspondiente.

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Jean-Pierre de Vera

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Contribuciones enumeradas según créditos de autoría. CL: conceptualización, diseño experimental, recuperación de especímenes, recuperación de datos (realización de todos los análisis/mediciones), análisis de datos, investigación, interpretación de datos, redacción (borrador original, revisión y edición). EB: interpretación de datos, investigación, redacción (revisión y edición). GP: redacción (revisión y edición). GA: contribución a las medidas de espectroscopia IR. RB: interpretación de datos, redacción (revisión y edición). JRB: redacción (revisión y edición). SG: responsable de Mars Simulation Facility-Laboratory, redacción (revisión y edición). JH: responsable del laboratorio de espectroscopia IR. SL: redacción (revisión y edición). AL: responsable de Mars Simulation Facility-Laboratory, redacción (revisión y edición). AM: responsable del laboratorio de espectroscopia IR, contribución a las medidas de espectroscopia IR. AP: protocolo de ultraestructura, observaciones TEM, interpretación de datos micromorfológicos, redacción (revisión y edición). JP.DV responsable de Mars Simulation Facility-Laboratory, interpretación de datos, redacción (revisión y edición). MB: conceptualización, diseño experimental, responsable de espectroscopia Raman, interpretación de datos, redacción (revisión y edición). Todos los autores leyeron, editaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a John Robert Brucato.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Lorenz, C., Bianchi, E., Poggiali, G. et al. Supervivencia del liquen Xanthoria parietina en condiciones ambientales marcianas simuladas. Informe científico 13, 4893 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32008-6

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Recibido: 20 enero 2023

Aceptado: 21 de marzo de 2023

Publicado: 25 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32008-6

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