Una impresora de vacunas de microagujas para COVID termoestable

Jun 09, 2023

Nature Biotechnology (2023)Citar este artículo

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La fabricación descentralizada de vacunas termoestables de ARNm en formato de parche con microagujas (MNP) podría mejorar el acceso a las vacunas en comunidades de bajos recursos al eliminar la necesidad de una cadena de frío y personal de atención médica capacitado. Aquí describimos un proceso automatizado para imprimir vacunas de ARNm de la enfermedad por coronavirus MNP 2019 (COVID-19) en un dispositivo independiente. La tinta de la vacuna está compuesta por nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm y una mezcla de polímeros solubles que se optimizó para una alta bioactividad mediante el cribado de formulaciones in vitro. Demostramos que los MNP resultantes son estables durante al menos 6 meses a temperatura ambiente cuando se evalúan utilizando una construcción de ARNm modelo. La eficiencia de carga de la vacuna y la disolución de las microagujas sugieren que se podrían administrar dosis eficaces a escala de microgramos de ARNm encapsulado en nanopartículas de lípidos con un solo parche. Las inmunizaciones en ratones que utilizan MNP producidos manualmente con ARNm que codifica el dominio de unión al receptor de la proteína del pico del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) estimulan respuestas inmunitarias a largo plazo similares a las de la administración intramuscular.

Las comunidades no vacunadas en países de bajos y medianos ingresos tienen un alto riesgo de brotes repetidos de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) y otras enfermedades infecciosas1, que aumentan la mortalidad, promueven la aparición de variantes más peligrosas y tienen un impacto negativo en la economía2. La vacunación masiva en estas comunidades se ha visto obstaculizada por problemas como una infraestructura inadecuada de almacenamiento y transporte compatible con la cadena de frío y una cantidad insuficiente de personal de atención médica3,4. Los sistemas locales distribuidos para fabricar vacunas adecuadas ofrecen una posible solución. Un formato de vacuna prometedor en estas regiones son los parches de microagujas termoestables (MNP)5,6,7,8. Los MNP se pueden autoaplicar, son menos dolorosos que la inyección intramuscular (IM), no producen residuos de objetos punzocortantes, se pueden formular para permanecer estables durante meses y se han utilizado con varios tipos de vacunas, incluidos varios ácidos nucleicos9,10,11, 12,13,14. En el contexto de COVID-19, las vacunas de ARNm encapsuladas en nanopartículas lipídicas (LNP), como las producidas por Moderna y Pfizer-BioNTech, han demostrado ser altamente efectivas para prevenir enfermedades graves. Hasta donde sabemos, la administración intradérmica (ID) de una vacuna de ARNm en un vehículo LNP utilizando un MNP con termoestabilidad a largo plazo no se ha informado previamente.

La fabricación de MNP presenta nuevos desafíos en la fabricación, la carga y la escalabilidad que han ralentizado su desarrollo, a pesar de ser ideales para su implementación en áreas de bajos recursos15,16,17,18. Para una dosificación precisa y una penetración adecuada en la piel, las microagujas deben estar afiladas y tener un tamaño uniforme de lote a lote19. Los MNP están limitados por el pequeño volumen disponible para la carga de vacunas, especialmente cuando se requieren excipientes para estabilizar antígenos lábiles20. Los MNP generalmente se fabrican a mano individualmente con pasos imprecisos, manuales e intensivos en mano de obra, como la centrifugación, lo que hace que la fabricación automatizada y consistente utilizando estos métodos sea un desafío21.

Aquí describimos una impresora de vacunas con microagujas (MVP) para fabricar MNP solubles cargados con vacunas de ARNm encapsuladas con LNP u otras cargas (Fig. 1a-c). La integración de un proceso de fabricación de microagujas dentro de un dispositivo modular independiente presenta desafíos únicos. La formación de microagujas, que generalmente se logra mediante moldeo22, fabricación de gotas23, impresión por inyección de tinta24,25 o impresión 3D26,27,28, debe producir microagujas con características nítidas, precisas y de escala micrométrica. El llenado de moldes debe ser impulsado por un proceso repetible que minimice el desperdicio, reduzca las piezas móviles, no requiera la interacción del usuario y se integre en un flujo de trabajo automatizado controlado por una máquina. En cada ejecución, el MVP dispensa tinta de vacuna, llena moldes de microagujas sin interrumpir la tinta mediante vacío para eliminar el aire a través del molde y acelera el secado mediante un flujo de trabajo automatizado con una intervención humana mínima. El flujo de trabajo automatizado integra un dispensador robótico de alta precisión, una cámara de vacío programable y etapas de movimiento modulares que contienen moldes de microagujas reutilizables. El proceso utilizado en el dispositivo se basa en la aplicación de vacío, compatible con una amplia gama de diseños de MNP y optimizado para minimizar el desperdicio de vacunas.

a, Las tintas modulares que contienen ARNm, lípidos y polímeros se pueden personalizar para la impresión de vacunas con microagujas. b,c, El MVP (b) se puede distribuir a áreas remotas para proporcionar capacidad de fabricación local (c) de MNP termoestables. d, Después de la dispensación automática, se aplica vacío a través de PDMS para cargar la solución de vacuna de polímero en el molde de microagujas. Luego, los moldes se transfieren a una estación de secado para un secado acelerado. e, Se midió el tiempo necesario para cargar la solución de polímero y vacuna en el molde de PDMS para varios parámetros de diseño y proceso. Se usaron pruebas t de dos colas no apareadas para todas las comparaciones, excepto para el tipo de polímero, donde se usó un ANOVA ordinario de una vía (n = 3 muestras independientes). f, Tasa de secado para diferentes estrategias de secado. ANCOVA se utilizó para comparar las estimaciones de la tasa de secado, que se derivaron de una regresión lineal de los datos de la tasa de secado (n = 3 muestras independientes). g, el área total de caída (n = 3 muestras independientes) y la cobertura del parche (n = 100 muestras independientes) son una función de la solución de polímero utilizada para dispensar. h, Imágenes de MNP fabricados con el dispositivo: MNP sobre respaldo acrílico sólido (arriba a la izquierda), imagen SEM de MNP con geometrías cónica (arriba a la derecha) y piramidal (abajo a la izquierda) y una sola pirámide MNP (abajo a la derecha). i, Imágenes de MNP cargados en la punta (delineados en blanco) co-dispensados ​​con el dispositivo utilizando tinte rojo (superior) o azul (inferior) como carga modelo. j, rendimiento de producción de MNP. k, rendimiento de MNP en función del tiempo de secado y la longitud de la bandeja de impresión. Los datos representan la media ± sd (p, g) o la media ± intervalo de confianza del 95 % (f). Los valores de P están representados por: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. NS, no significativo.

La impresión con microagujas requiere la incorporación de un polímero soluble estabilizador en una tinta mRNA-LNP consistentemente dispensable. Después de examinar exhaustivamente las tintas in vitro, determinamos que una combinación de polímeros solubles podría proporcionar con éxito ARNm encapsulado en LNP activo y mantener la estabilidad durante al menos 6 meses a temperatura ambiente. Usando ARNm que codifica el dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína de pico (S) SARS-CoV-2, mostramos que los MNP producidos por el MVP tienen propiedades mecánicas adecuadas y penetran con éxito en la epidermis porcina tras la aplicación ex vivo. Las pruebas in vivo de MNP producidos manualmente demostraron una respuesta inmune similar a la de la administración IM.

Desarrollamos una técnica basada en vacío para introducir tintas de vacunas viscosas en moldes. El proceso se basa en la permeabilidad del aire y la solubilidad en polidimetilsiloxano (PDMS)29. Al aplicar vacío ya sea directamente en la parte inferior del molde de PDMS durante el llenado (Fig. 1d y datos extendidos Fig. 1a) o predesgasificando el molde de PDMS inmediatamente antes del llenado (datos extendidos Fig. 1b), soluciones viscosas de polímero y vacuna podría cargarse en moldes (Videos complementarios 1 y 2).

Se estudió el efecto de varios parámetros de proceso y diseño en el tiempo de carga y la formación de MNP para ambos enfoques (Datos extendidos Fig. 1c-j). Cuando se aplica vacío directamente al molde, el tiempo de carga depende del grosor y la composición de la hoja de PDMS, el patrón utilizado para aplicar vacío debajo del molde de PDMS y el gradiente de presión aplicado (Fig. 1e). La carga de tintas cada vez más viscosas (datos extendidos Fig. 1k) requirió menos de 20 min. Aunque la aplicación de vacío durante la fabricación de microagujas es común, normalmente se aplica vacío a la atmósfera por encima del molde, lo que da como resultado la formación de burbujas en la vacuna y la solución de polímero30,31. La aplicación de vacío directamente al molde de PDMS evita la formación de burbujas y elimina la necesidad de centrifugación, lo que proporciona un proceso repetible que permite la automatización y se puede ampliar o reducir para cumplir con cualquier tamaño o cantidad de MNP.

Para reducir el desperdicio de vacunas y el tiempo de secado, dispensamos el volumen mínimo posible de tinta de vacuna necesaria para llenar las microagujas. Ajustamos la concentración de polímero para producir una película delgada y homogénea de polímero seco con suficiente resistencia mecánica para sobrevivir al desmoldeo (Datos extendidos Fig. 2a). La dispensación se caracterizó por el área de gota de tinta dispensada y la circularidad del respaldo formado después del secado. Al aumentar la viscosidad para minimizar el efecto Marangoni, que lleva el polímero y la vacuna a los bordes de la gota que se está secando, maximizamos la circularidad y la cobertura del molde, medido en agujas llenas por molde (Datos extendidos Fig. 2b, c). Usando el análisis termogravimétrico para evaluar el tiempo de secado, determinamos que la aplicación simultánea de vacío debajo y una atmósfera de vacío desecada arriba, los moldes MNP aceleraron el secado del parche sin formación de burbujas (Fig. 1f y Nota complementaria 1).

Para minimizar la interacción del usuario y la necesidad de capacitación en el sitio, los procesos anteriores se automatizaron utilizando componentes programables. Se fabricó una etapa de traducción x-y personalizada con vacío debajo (carga) y arriba (secado), que acomoda hasta 100 moldes MNP a la vez (Video complementario 3 y datos extendidos Fig. 3a-e). Los procesos de carga al vacío y secado al vacío se combinaron con un brazo robótico para una dosificación repetible y programable con una precisión de escala de microlitros (videos complementarios 4 y 5 y datos extendidos, figura 3f). Los parámetros como el patrón de dispensación, el volumen dispensado y la altura de dispensación se optimizaron para minimizar el desperdicio de vacunas y producir MNP con un respaldo ultrafino (Datos extendidos Fig. 3g-k). Con un conjunto de parámetros de dosificación, se dosificaron tres sistemas de polímeros solubles diferentes con una cobertura de molde superior al 80 % (Fig. 1g). El MVP permitió la fabricación automatizada de varios diseños de microagujas, incluidas matrices de 10 × 10 (datos extendidos Fig. 3l) de microagujas piramidales y cónicas de hasta 1500 µm de altura hechas de una selección de polímeros solubles comunes para la administración de vacunas utilizando MNP (Fig. 1h ).

La vacuna que se seca en el respaldo de la MNP crea desechos adicionales de vacunas. Para reducir el desperdicio, implementamos un proceso de carga de puntas de dos pasos que se ha utilizado anteriormente para concentrar vacunas en puntas de microagujas8,32. En primer lugar, se carga en el molde y se seca una tinta de vacuna que contiene la cantidad mínima de polímero necesaria para estabilizar la vacuna. Luego, se dispensa una tinta de polímero únicamente y se seca para formar el respaldo (datos extendidos, Fig. 4a,b). El MVP también se puede usar para cargar múltiples cargas simultáneamente, como lo demuestra la carga de tinte rojo y azul en diferentes MNP (Fig. 1i). Los MNP cargados en la punta impresos con el MVP tienen microagujas afiladas formadas correctamente al 100% (Datos extendidos Fig. 4c).

Se desarrolló un modelo matemático para cuantificar la cantidad de parches que se pueden fabricar por día en función de diferentes parámetros de diseño (Notas complementarias 2 y 3 y Datos extendidos Fig. 4d-g). El rendimiento del MVP está limitado por el paso del proceso más lento, que puede ser el paso de dispensación o el paso de secado según el tamaño del dispositivo, lo que demuestra la importancia de comprender ambos (Fig. 1j). El procesamiento continuo es posible cuando los procesos de los componentes están siempre en ejecución y los rendimientos de dispensación y secado son iguales. Se trazaron varios contornos de diseño para capturar el rendimiento de cualquier dispositivo considerando parámetros como el tiempo de secado y la dimensión de la bandeja de carga (Fig. 1k) o el tamaño del parche (Datos extendidos Fig. 4d).

Aunque una impresora de primera generación es capaz de fabricar 100 parches en 48 h, esto se puede aumentar cambiando el tamaño y la complejidad de la etapa de dispensación y el área de secado. El modelo puede ser una herramienta integradora para informar las consideraciones de diseño para aumentar el rendimiento. Esto se puede lograr de manera eficiente apilando moldes modulares de bandejas de microagujas verticalmente dentro del MVP (datos extendidos Fig. 5a, b) o fabricando continuamente MNP utilizando una etapa de pretratamiento para desgasificar las bandejas de moldes de microagujas antes de dispensar (datos extendidos Fig. 5c ). La eliminación y el empaque del parche también podrían automatizarse potencialmente en diseños futuros utilizando un brazo robótico (Datos extendidos Fig. 5d-g).

Luego, el MVP se usó para cargar varios productos biológicos, específicamente LNP cargados con proteínas, ADN y ARNm. La carga de la punta en dos pasos con BSA aumenta notablemente la eficiencia de la carga, definida como el porcentaje de la carga utilizada para la fabricación que se mide en las puntas de las microagujas, en comparación con la fabricación MNP de un paso (Fig. 2a). Luego, se optimizó la masa de la tinta de la vacuna que se usa durante el primer paso del proceso de dos pasos para lograr una alta eficiencia de carga (datos extendidos, Fig. 6a,b). Observamos que la eficiencia de carga aumenta con la masa de formulación decreciente (Datos extendidos Fig. 6c). Usando el mejor procedimiento de carga, se cargaron en la punta 32 µg de ADN y 90 µg de BSA y se dispensaron simultáneamente usando el MVP, con una eficiencia de carga similar (Fig. 2b). La carga lograda con el MVP coincidió con la que se obtiene cuando los MNP se fabrican manualmente mediante técnicas de laboratorio estándar, lo que confirma aún más la automatización exitosa del proceso de fabricación para varios antígenos y vectores (Fig. 2b). La altura de dispensación se redujo para reducir la variación de la carga (Datos ampliados, Fig. 6d). La carga de una vacuna de ADN es consistente (sd = 1,6 µg) en la superficie de una bandeja con 100 moldes MNP sin tendencias detectables en función de la posición (Fig. 2c y Datos extendidos Fig. 6e).

a, Eficiencia de carga de microagujas de uno y dos pasos (n = 6 muestras independientes). b, la eficiencia de carga de ADN y proteínas en los MNP hechos manualmente es similar a los hechos usando el MVP (n = 4-9 muestras independientes). c, Mapa de calor que muestra la carga constante de ADN en MNP en una bandeja de 10 × 10 de moldes de MNP. Cada cuadrado es un parche individual. Las flechas negras indican el movimiento del dispensador de vacunas. d, los MNP consisten en polímero estabilizador y LNP, que tienen cuatro componentes lipídicos. e, f, los LNP que encapsulan el ARNm que codifica fLuc se mezclaron con varios polímeros solubles en agua y se secaron. La expresión de proteínas en células HeLa se midió después de la transfección con polímero redisuelto para detectar una combinación de polímeros que produce una expresión de proteínas similar a los LNP en suspensión (n = 4 réplicas técnicas). g, las microagujas se disuelven y administran vacunas mRNA-LNP en el espacio intradérmico. h, luminiscencia 6 h después de la aplicación de MNP en ratones para LNP fabricados con lípido 5 o cKK-E12 (n = 5 muestras biológicamente independientes). i, Comparación de la administración IM, MNP fabricada manualmente y MNP impresa de LNP Lípido 5 que contienen 1 µg de ARNm de fLuc (n = 5 muestras biológicamente independientes). Los datos representan la media ± sd (a,b,e,f) o la media ± sem (h,i). Se utilizaron pruebas t de dos colas no apareadas (a, b), ANOVA de dos vías ordinaria (h) o ANOVA de una vía ordinaria (i) (prueba de comparaciones múltiples de Sidak). Los valores de P están representados por: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. promedio, promedio; dev., desviación; NS, no significativo.

A continuación, probamos la impresión de MNP que incorporan mRNA-LNP estabilizados en una matriz de polímero soluble. Los LNP son especialmente difíciles de secar en una matriz sólida porque se debe preservar tanto la estabilidad química como la coloidal33. Además, el volumen de polímero disponible en las microagujas es limitado, lo que dificulta la prevención de la agregación de LNP. Para investigar polímeros solubles para estabilizar LNP, comparamos varios polímeros biocompatibles que se usan comúnmente para fabricar microagujas solubles en función de su capacidad para mantener la estabilidad de LNP en proporciones de masa de polímero a ARNm decrecientes. Se fabricaron LNP de aproximadamente 147 nm de diámetro y -2,7 ± 0,6 mV de potencial de superficie que encapsulaban el ARNm que codificaba la luciferasa de luciérnaga (fLuc) usando lípidos ionizables, fosfolípidos, colesterol y lípidos pegilados (Fig. 2d y Datos extendidos Fig. 7a-c)34.

Luego, los LNP se mezclaron con varios polímeros solubles y se secaron. Después de la redisolución de la matriz seca, se usaron LNP para transfectar células HeLa, y se midieron tanto la viabilidad celular como la expresión de fLuc en relación con LNP frescos sin secar. Ninguna de las formulaciones probó la viabilidad celular deteriorada en comparación con los LNP solos (Datos extendidos, Fig. 7d). Las formulaciones que contienen más del 50 % de alcohol polivinílico (PVA) de la masa total son las mejores para estabilizar las LNP (Fig. 2e), mientras que otros materiales comunes de MNP solubles funcionan mal (Fig. 2f). La velocidad de secado lenta del PVA (datos extendidos Fig. 7e), la higroscopicidad y la viscosidad (datos extendidos Fig. 1k) se pueden superar mezclándolo con polivinilpirrolidona (PVP, un polímero de secado más rápido con propiedades mecánicas deseables (datos extendidos Fig. 7f, g) )—sin sacrificar la estabilidad. Los LNP están intactos después de la disolución de la matriz polimérica de MNP—mostrando un aumento moderado en el diámetro (Datos extendidos Fig. 7h), estructura típica en microscopía electrónica de transmisión (TEM) (Datos extendidos Fig. 7i–k) y conservados Tamaño del ARNm (datos extendidos Fig. 7l).

Buscamos seleccionar una formulación de LNP adecuada para la administración ID a través de MNP (Fig. 2g) de dos lípidos ionizables líderes diferentes con estructuras y pKa muy diferentes: cKK-e12 y Lípido 5 (refs. 34, 35, 36). Se informó ampliamente que cKK-e12 es eficaz en la administración de oligonucleótidos por vía intravenosa (IV), mientras que el lípido 5 se seleccionó de una familia de lípidos estudiados para la administración tanto IM como IV. Los LNP de cada tipo que encapsulan el ARNm de fLuc se caracterizaron (datos extendidos, Fig. 7a-c) y se cargaron en las microagujas de los MNP utilizando la mejor formulación de polímero soluble estabilizador y el método de carga más eficiente, es decir, relación de masa PVP:PVA 1:1 y fabricación en dos pasos. Se midió la carga de mRNA encapsulado en cada una de las 100 microagujas de un MNP. Descubrimos que, aunque la distribución de ARNm dentro del MNP es heterogénea, la variación de lote a lote es baja, con aproximadamente 1,0 µg de punta de ARNm cargada por MNP (datos extendidos Fig. 7m–p). La expresión de proteínas después de la transfección de HeLa con LNP o LNP redisueltos del parche de microagujas mostró que el proceso de fabricación de MNP no afecta la actividad de LNP in vitro (Datos extendidos Fig. 7q). Se aplicaron MNP a la almohadilla plantar de los ratones y se midió la expresión de fLuc mediante luminiscencia37. Los LNP con lípido 5 tienen una expresión de proteína mucho mayor en respuesta a la dosis que cKK-e12 (Fig. 2h), lo que es prometedor para un uso posterior en la administración de ID.

Para investigar la administración ID de una vacuna de ARNm basada en LNP usando MNP, nuevamente medimos la expresión de proteína in vivo usando ARNm de fLuc encapsulado en LNP, esta vez comparando la aplicación ID de MNP en la almohadilla de la pata con la administración IM de una cantidad equivalente de ARNm de fLuc en LNP (Fig. .2i). La expresión de proteínas a las 24 h es significativamente mayor cuando los LNP se administran a través de MNP en lugar de inyección IM. También comparamos la expresión de proteínas cuando los MNP se fabricaron manualmente frente a los impresos con el MVP. El proceso de impresión automatizado no afecta la actividad LNP in vivo (Fig. 2i).

Evaluamos las propiedades mecánicas y funcionales de los MNP producidos con la combinación de polímeros más capaces de estabilizar los LNP. Tanto las agujas cónicas como las piramidales se consideraron geometrías potencialmente viables que ofrecen volúmenes de aplicación y ángulos de punta variables (datos ampliados, figura 8a y tabla complementaria 1), que se ha demostrado que influyen en la penetración y disolución de la piel38. Tanto en términos de fuerza máxima (Fig. 3a) como de rigidez (Fig. 3b), los MNP piramidales hechos de PVP:PVA superan a los MNP cónicos de la misma composición, y todos los MNP cumplen con los requisitos mínimos para perforar la piel39. Para ambas geometrías, la punción de piel de cerdo ex vivo (Fig. 3c) se evaluó mediante histología, y la disolución de microagujas se evaluó mediante análisis de imagen de microscopía óptica (Fig. 3d, e y Datos extendidos Fig. 8b). Aunque ambas geometrías pueden acceder a la dermis, el 36 % del volumen de la microaguja piramidal se disolvió en 10 min en comparación con solo el 8 % del volumen de la microaguja cónica, lo que permitió una mayor administración de la vacuna, posiblemente debido a su ángulo de punta más pequeño y más agudo40. Por lo tanto, se utilizaron MNP piramidales para todos los experimentos siguientes. El aumento de la fracción de PVP (datos extendidos Fig. 8c–e) y LNP (datos extendidos Fig. 8f) en la mezcla se puede utilizar para aumentar el volumen disuelto.

a,b, los MNP piramidales hechos de PVP:PVA son más rígidos (a) y más resistentes (b) que los MNP cónicos de tamaño similar (n = 10 muestras independientes). Pruebas t de dos colas no apareadas. c, los MNP tanto cónicos como piramidales son capaces de penetrar (flechas negras) en la epidermis (e) y acceder a la dermis (d) para la entrega de identificación. d, e, los MNP piramidales se disuelven significativamente más rápido que los MNP cónicos utilizando imágenes ópticas e antes y después de la aplicación (n = 3 muestras independientes). Pruebas t de dos colas no apareadas. f, los GMT son similares entre IM y MNP para el ARNm de SARS-CoV-2 RBD (n = 5 muestras biológicamente independientes). ANOVA ordinario de dos vías (prueba de comparaciones múltiples de Sidak). g, títulos de IgG de proteína anti-RBD hasta la semana 11, que muestran las diferentes cinéticas de las respuestas humorales entre la administración de MNP e IM y respuestas similares para el ARNm de SARS-CoV-2 RBD (n = 5 muestras biológicamente independientes). h, Respuestas del ensayo de unión anti-RBD en suero de electroquimioluminiscencia para variantes de SARS-CoV-2 que muestran respuestas similares para IM y MNP con ARNm de RBD de SARS-CoV-2 (n = 5 muestras biológicamente independientes). ANOVA ordinario de dos vías (prueba de comparaciones múltiples de Sidak). i, PVP:PVA estabiliza mRNA-LNP en MNP para una alta expresión de proteínas después de 6 meses de almacenamiento a temperatura ambiente (n = 5 muestras biológicamente independientes). Cada conjunto de datos se traza con un ajuste lineal y el intervalo de confianza del 95 % está sombreado. j, Relación de diseño para cumplir con los requisitos de dosificación en humanos para vacunas de ARNm comunes, que ilustra la relación entre el volumen de una sola microaguja, las microagujas por MNP y la dosis administrada en una sola MNP. Las flechas negras indican el tamaño (en microagujas por MNP) en el que se satisface una dosis humana de ARNm para el volumen de microaguja único constante utilizado en estos estudios. Los datos representan la media ± sd (a,b,d) o la media ± sem (f–i). Los valores de P están representados por: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. MPa, megapascales; N, Newton; NS, no significativo.

Para desarrollar una vacuna contra el SARS-CoV-2 para su administración por MNP, utilizamos un ARNm que codifica el RBD, modificado con un motivo de trimerización T4, similar al constructo en la vacuna BNT162b1 (datos extendidos, figura 9a)41. Antes de la carga en dos pasos, los LNP que contenían ARNm de SARS-CoV-2 se dializaron en agua y se concentraron mediante filtración centrífuga para aumentar la capacidad de carga de MNP (datos extendidos, Fig. 9b,c)42. Para los LNP, la eficiencia de carga también aumentó al hacer MNP más pequeños, lo que limita el efecto Marangoni al área cubierta por microagujas en lugar del perímetro del parche (Datos extendidos Fig. 9d, e). De lo contrario, los MNP se fabricaron de acuerdo con la carga en dos pasos descrita en las Figs. 1 y 2, utilizando PVP:PVA 1:1 en una relación de masa de 0,32 (mg µg –1) para estabilizar los LNP y el lípido 5 ionizable para maximizar la expresión de proteínas intradérmicas. Usamos células HEK para confirmar la expresión de los vectores basados ​​en ARNm de SARS-CoV-2 (Datos extendidos Fig. 9f).

Según informes anteriores, utilizamos un modelo de ratón para evaluar la inmunogenicidad de la vacuna contra el SARS-CoV-243. Las vacunas se administraron a una dosis de 6 μg de ARNm encapsulado (datos extendidos Fig. 9g-i) a través de MNP en la almohadilla plantar de ratones C57BL/6, y se administró un refuerzo de MNP 28 días después (datos extendidos Fig. 10a). Como control, se administró una suspensión de ARNm-LNP en una dosis de ARNm de 10 μg mediante inyección IM en la pata trasera con el mismo programa. El suero se recogió cada 2 semanas y se analizó para fijar los títulos de IgG anti-RBD. A las 3 semanas después del refuerzo, medimos títulos medios geométricos (GMT) similares entre IM y MNP para la vacuna de ARNm de RBD (Fig. 3f). Las respuestas posteriores al cebado son más bajas que las informadas para las vacunas autorizadas de ARNm-LNP contra el SARS-CoV-2 en un modelo C57BL/6, que utiliza diferentes lípidos y ARNm, pero las respuestas posteriores al refuerzo son similares43,44.

Aunque todos los ratones que reciben mRNA-LNP finalmente producen GMT altos, aquellos que los reciben IM responden dentro de 1 semana al refuerzo, mientras que aquellos que los reciben a través de MNP responden dentro de 3 semanas al refuerzo (RBD mRNA; Fig. 3g). También observamos que la cinética de la expresión de FLuc después de la administración de MNP es más lenta que la administración IM (Datos extendidos Fig. 10b). Esto es de esperar dado que los mRNA-LNP se disuelven desde una matriz sólida en la piel a través de MNP, pero un retraso en la expresión de proteínas puede ayudar a explicar el retraso en la respuesta inmunitaria en comparación con la dosificación de suspensión líquida. Dados los GMT pico ligeramente más bajos, pero similares (Fig. 3f) y sus correlatos de protección con la infección por SARS-CoV-2, los MNP de ARNm de RBD, sin embargo, produjeron una respuesta inmune sólida dentro de un período de tiempo factible después de la administración45. Utilizamos un ensayo de electroquimioluminiscencia multiplexado para examinar las respuestas de unión anti-RBD en suero a las variantes de la proteína S del SARS-CoV-2 con diferentes mutaciones de interés para demostrar la amplitud de la protección que ofrece la vacuna MNP (Fig. 3h).

Comparamos la combinación de PVP:PVA que se desarrolló para la administración de ARNm-LNP con microagujas con una suspensión convencional de ARNm-LNP administrada IM a la misma dosis, utilizando el ARNm de fLuc como modelo para la expresión de proteínas en ratones. Ambos se almacenaron a temperatura ambiente ya 4 °C y se evaluaron 1 mes, 3 meses y 6 meses después in vivo. Aunque la potencia de la suspensión IM disminuye durante 6 meses, los MNP producen una luminiscencia alta constante durante todo el período de almacenamiento (Fig. 3i), incluso cuando se almacenan a temperatura ambiente. Los MNP también mantienen estables los mRNA-LNP cuando se almacenan a 37 °C durante 1 mes, lo que coincide con el tiempo de almacenamiento entre el cebado y el refuerzo (datos extendidos, figura 10c). En un estudio similar, los MNP de ARNm de RBD son inmunogénicos después de al menos 3 meses de almacenamiento a temperatura ambiente y 4 °C (datos extendidos, Fig. 10d), cuando se usan como refuerzo para ratones BALB/c cebados con suspensión de ARNm-LNP.

Administrar una dosis suficiente de vacuna LNP con MNP es un desafío debido a la masa de polímero necesaria para estabilizar las LNP. Usando el volumen de la aguja y la eficiencia de carga de MNP del estudio de pico de títulos anti-RBD, diseñamos un modelo (Fig. 3j y Nota complementaria 4) que predice la combinación de volumen y número de microagujas necesarias para administrar el Moderna completo (ARNm-1273 ) o Pfizer-BioNTech (BNT162b1) dosis de vacuna COVID-19. El modelo predice que 360 ​​y 108 de las microagujas piramidales estudiadas y la formulación administrarían la dosis completa de las vacunas Moderna y Pfizer-BioNTech, respectivamente. Los MNP que contienen una dosis suficiente tienen menos de 2 cm de ancho.

Aunque las magnitudes de las respuestas humorales son similares, observamos diferencias interesantes entre la administración IM de la suspensión de mRNA-LNP y la entrega ID de mRNA-LNP utilizando MNP. Los mRNA-LNP que incorporan el lípido 5 superaron a los que tenían cKK-E12 en términos de expresión de proteínas (Fig. 2h), lo que sugiere que los MNP pueden ser sensibles a la composición de lípidos ionizables. Los lípidos ionizables gobiernan la expresión y el direccionamiento de proteínas y se han optimizado para varios órganos y vías de administración34,35,46,47. Las respuestas humorales también desarrollan una MI más rápida (Fig. 3g). Investigaciones previas sobre vacunas basadas en microagujas sugieren una conexión entre el método de administración y la cinética de la respuesta humoral48,49. Esto puede reflejar la disolución más lenta de la matriz MNP (datos extendidos, figura 10b) o diferencias fundamentales entre la administración de ID e IM. Estas diferencias resaltan oportunidades para investigar y diseñar más a fondo la potencia de los mRNA-LNP administrados por los MNP. Además, las construcciones de ARNm de RBD pueden justificar un mayor estudio como objetivo para vacunas con mayor estabilidad50.

Los MNP que contienen mRNA-LNP ofrecen nuevas oportunidades para optimizar la administración de vacunas y mejorar la eficacia de la vacuna. La administración ID de virus atenuados, partículas similares a virus y otras vacunas puede permitir el ahorro de dosis en comparación con las rutas IM o subdérmicas51,52. En una reunión del Grupo de Expertos Asesores Estratégicos de la Organización Mundial de la Salud se recomendó la entrega de vacunas por identificación como un medio para reducir el costo de la vacuna contra la poliomielitis, y se autorizó una vacuna de ADN administrada por identificación a través de un inyector de chorro para uso de emergencia en la India53,54. Las vacunas estables a temperatura ambiente facilitarían en gran medida el despliegue en el mundo en desarrollo, donde la cadena de suministro necesaria para el transporte en frío puede ser inadecuada. También permitirían almacenar vacunas de manera rentable en preparación para un posible brote55. El despliegue de las vacunas COVID-19 en particular se ha visto obstaculizado por la vida útil deficiente y la dependencia de los sistemas de almacenamiento y transporte de la cadena de frío. Hasta ahora, hasta donde sabemos, no se han desarrollado vacunas termoestables de mRNA-LNP33,56, quizás debido a su naturaleza nanoparticulada (por ejemplo, área de superficie muy alta) y tendencia a agregarse irreversiblemente, lo que las hace excepcionalmente difíciles de estabilizar en un medio seco. formulación33,57,58,59.

Mostramos que las vacunas MNP impresas por el MVP pueden almacenarse a temperatura ambiente y usarse para inmunizaciones meses después de la fabricación. Por el contrario, ciertas vacunas de ARNm actuales deben mantenerse entre -60 °C y -80 °C para el almacenamiento a largo plazo y 4 °C para el almacenamiento a corto plazo. Los datos de modelado sugieren que una dosis humana de la vacuna mRNA-LNP COVID-19 se puede formular en un parche de microagujas de 2 cm cuadrados (Fig. 3j). Esto supone que el espacio entre agujas se mantiene a medida que aumenta el tamaño del parche, pero, para una eventual traducción, se debe evaluar la penetración en la piel y la disolución de la aguja de un parche más grande. Se requerirá ingeniería adicional del MVP para desarrollar un proceso de fabricación de microagujas de extremo a extremo para su aplicación en humanos, incluido un recinto aséptico para reducir la carga biológica y un paso de empaque integrado60,61. Creemos que el dispositivo podría adaptarse fácilmente a cualquier vacuna de ARNm para enfermedades de interés en regiones específicas y dimensionarse de acuerdo con la escala deseada de producción de vacunas MNP.

El MVP se diseñó con el requisito de integrar y automatizar las funciones necesarias para convertir los ingredientes necesarios para fabricar MNP en MNP terminados con un nivel mínimo de habilidad del operador y en un factor de forma adecuado para el transporte. El diseño resultante constaba de tres funciones principales: carga, dispensación y secado. Estas tres funciones se organizaron en el MVP (Datos extendidos Fig. 3f) y se programaron para funcionar simultáneamente. Toda la programación relacionada con MVP se implementó en el lenguaje de programación EPSON RC 7.0 SPEL. Se requiere que el operador cargue moldes, llene los depósitos para formulación líquida y soporte de polímero y descargue MNP.

Se desarrolló una función operativa clave de modo que, durante el paso de dispensación, la formulación líquida se dispensa primero por encima del molde del MNP y luego se extrae dentro de la cavidad del molde negativo usando vacío por debajo (tomando aproximadamente 15 min), y luego la etapa de carga se mueve hacia la estación de secado donde se sella su atmósfera para acelerar el tiempo de secado.

La etapa de dispensación consiste en una bomba de jeringa (Harvard PHD 2000) y un brazo robótico (Epson T3) que sostiene un par de boquillas (agujas de calibre 18 para soluciones de tinte, calibre 25 para impresión de vacunas) conectadas a través de un tubo a la bomba de jeringa. El movimiento del brazo robótico se programó para sincronizarse con la bomba de jeringa. El movimiento de la bomba/brazo robótico se optimizó para maximizar la cobertura del molde MNP por la formulación líquida. Se impuso un intervalo de tiempo de dispensación entre cada dos MNP adyacentes para minimizar el goteo entre parches y el desperdicio de vacunas.

Ambos procesos se basaron en diferentes secuencias de aplicación de vacío en moldes de PDMS y dispensación de la solución de polímero (cargada con tinte o agentes biológicos), seguido de secado al vacío. En el primer proceso (desgasificación), inicialmente se aplicó vacío en moldes de PDMS vacíos, seguido de la dispensación de solución de polímero dentro de un tiempo específico (~ 7 min) justo después de la aplicación de vacío, y finalmente se secó la solución de polímero con vacío. La desgasificación al vacío facilitó la difusión de la solución de polímero en las cavidades de microagujas en el molde PDMS (datos extendidos, figura 1b y video complementario 1). En el segundo enfoque, la solución de polímero se dispensó en el molde de PDMS y, posteriormente, se aplicó vacío por debajo y por encima de las láminas (datos ampliados, figura 1a y video complementario 2) para inducir la difusión del polímero, pero también para acelerar el tiempo de secado. sin formación de burbujas. Al secar la solución con vacío, es importante mantener el gradiente de presión a través del molde de PDMS manteniendo una presión negativa más alta debajo de la hoja de PDMS. Al hacerlo, el aire disuelto en la solución de polímero y vacuna es impulsado hacia abajo (hacia la cámara de vacío debajo del molde PDMS), lo que evita la formación de burbujas durante el secado. Debido a la simplicidad de la automatización, el segundo enfoque se implementó aún más en el dispositivo.

La etapa de carga fue una matriz de 10 × 10 hecha a medida de moldes MNP, que se utilizó para aplicar vacío (-1 bar) debajo de las hojas de PDMS. La etapa de carga se fijó a una etapa de movimiento de un solo eje (Thorlabs) que permitía la transferencia entre la estación de carga y la estación de secado. Antes de dispensar la formulación, se calibró la alineación de la estación de carga con la estación de dispensación.

La etapa de secado era una cámara de vacío hecha a medida que se movía verticalmente a través de una etapa de movimiento de un solo eje (Thorlabs). La cubierta superior constaba de una conexión de vacío y de una bolsa desecante (Datos ampliados, Fig. 3c). El vacío se ajustó a -0,6 bar para acelerar el secado. Se utilizó una sola bomba de vacío para las etapas de carga y secado. La bomba de vacío se conectó directamente a la etapa de carga y se utilizó un controlador de presión para disminuir el vacío a -0,6 bar en la cubierta superior. El menor vacío en la cubierta superior en comparación con el interior de la etapa de carga mantuvo un gradiente de presión negativo en la lámina de moldes de PDMS, lo que evitó la formación de burbujas en las soluciones de MNP. Además, el controlador de presión se utilizó para devolver automáticamente la etapa de secado a la presión atmosférica después del secado y liberar la cámara de vacío de la etapa de carga.

Se distribuyeron parches (n = 100) y se secaron con MVP para estudiar el efecto de la formulación líquida en la cobertura del parche causada por diferentes patrones de secado en MNP individuales. La formulación líquida incluía una formulación polimérica (PVP, PVA, PVP:PVA 1:1) disuelta al 20% (p/p) en PBS y mezclada con colorante. La cobertura del parche se definió como el número de microagujas formadas con éxito después del secado dividido por el número total de parches fabricables (100). La cobertura del parche se cuantificó individualmente para cada parche bajo un microscopio óptico para cada formulación. El área de caída y la circularidad se cuantificaron mediante el análisis de imágenes después de la obtención de imágenes.

Se siguió un enfoque de dispensación de dos pasos para cargar vacunas y otras cargas biológicas. En el primer paso, la solución de vacuna se aspiró en el tubo dispensador a través de las agujas dispensadoras (calibre 25, BD Biosciences). La formulación líquida en el primer paso estaba compuesta por una determinada concentración del agente biológico mezclado con PVP:PVA 1:1, 4% (p/p). Luego se dispensaron aproximadamente 36 ± 6 µl de solución de vacuna (u otras cargas) utilizando un par de jeringas de 1 ml (BD Biosciences) en el centro de los moldes de MNP en la bandeja de dispensación. Se impuso un intervalo de tiempo de 9 s entre la dispensación de cada dos MNP adyacentes para minimizar el desperdicio de vacunas durante la transferencia del robot dispensador de un molde a otro. La solución de respaldo (PVP:PVA 1:1, 20 % (p/p)) se aspiró directamente a una jeringa dispensadora nueva (de 10 ml, BD Biosciences). Se dispensó una cantidad de 48 ± 6 µl de la solución de respaldo en la segunda etapa justo encima de las manchas de vacuna previamente dispensadas (secas). Antes y después de cada ronda de dispensación, las agujas y los tubos se lavaron con etanol (70 %) y luego con agua estéril. En algunos experimentos, se dispensó conjuntamente un par de cargas de modo que cada jeringa/aguja dispensara una carga diferente. En este caso se siguió el mismo procedimiento de carga/dispensación que en monodispensación, excepto que cada jeringa se cargó con una carga diferente.

Se utilizó SolidWorks 2021 (Dassault Systèmes) para las ilustraciones en 3D del MVP, el brazo robótico, la estación dispensadora, los dispositivos de vacío, la cámara de presión negativa, el contenedor de ambiente estéril, la rejilla de secado, la cinta transportadora y la estación automática de desmoldeo de parches con microagujas. El dibujo del brazo robótico Epson T3 se descargó directamente del sitio web oficial de Epson. Los modelos de plotter XYZ, rejilla de secado y cinta transportadora se descargaron de GrabCAD. Todas las demás piezas se diseñaron a medida en referencia a las dimensiones reales de las piezas del prototipo.

Se siguió un enfoque de diseño de experimentos (DOE) para estudiar sistemáticamente el efecto de varios parámetros de diseño en el tamaño colectivo de las gotas, como la respuesta de salida, dispensada en una matriz de PDMS individual desde la boquilla robótica (aguja). Para ello, se construyó un diseño de experimento de matriz ortogonal L18 (Taguchi DOE) en software (Minitab). Se estudió el efecto de los siguientes parámetros de diseño: (1) conexión de un filtro de 0,2 µm a la boquilla, (2) calibre de la aguja, (3) altura de dosificación, (4) caudal de dosificación y (5) viscosidad del polímero como función de la composición del polímero. El área de caída proyectada del total de gotas al final de cada dispensación se cuantificó utilizando el software ImageJ. Los resultados (n = 3–5) se analizaron en Minitab para encontrar la respuesta media del área de caída en función del cambio en estos parámetros. Una ilustración esquemática de la configuración experimental se muestra en Datos extendidos Fig. 3g. El volumen total dispensado se consideró constante e igual a 200 µl. Se consiguieron diferentes caudales manteniendo constante el volumen total dispensado (200 µl) pero variando la duración de la dispensación.

Los MNP se imprimieron con el MVP automatizado y se tomaron imágenes con un microscopio óptico para determinar si las microagujas tenían la longitud completa y estaban afiladas (n = 30). Se utilizó el análisis de imágenes para estimar la altura de la aguja.

Se utilizó microscopía electrónica de barrido (SEM) para obtener imágenes de microagujas fabricadas. Las muestras se recubrieron inicialmente con una capa delgada de Au/Pd usando un sistema de pulverización catódica Hummer 6.2 (ANATECH) y luego se tomaron imágenes usando un JSM-5600LV SEM (JEOL) con un voltaje de aceleración de 5–10 kV.

Los positivos de MNP de acero se usaron para generar moldes negativos hechos de PDMS (Sylgard 184, Dow Corning), que se mezcló de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se curó durante la noche a 60 °C. Para crear positivos de MNP adicionales, los moldes negativos de PDMS se llenaron con el adhesivo óptico Norland 61 de curado UV usando una centrífuga a 3234 g durante 1 min, se colocaron en un horno de curado UV a temperatura ambiente durante 20 min y se retiraron manualmente.

Para crear una bandeja de moldes negativos, primero se alinearon los positivos MNP utilizando una rejilla acrílica de 5 × 5 cortada con láser. Luego, se vertió el adhesivo óptico Norland 61 entre las réplicas positivas de resina individuales, se curó con UV a temperatura ambiente durante 20 minutos y luego se mantuvo a 60 °C durante la noche. La bandeja resultante de MNP positivos de 5 × 5 espaciados uniformemente (Datos extendidos, Fig. 3d) se usó para fabricar una hoja de PDMS de 5 × 5 de moldes negativos (Datos extendidos, Fig. 3e). Se usó PDMS para cubrir los positivos de resina alineados y crear una capa adicional de PDMS de 1 mm por encima de los positivos. La hoja se niveló, se curó durante la noche a 60 °C y se retiró con isopropanol para ayudar a separar el negativo del positivo.

Los MNP se fabricaron cargando y secando 200 µl de una solución de PVP, PVA o PVP:PVA al 20 % p/p en un molde de PDMS. Cuando se cargaron colorantes, LNP, ADN o proteínas en el MNP, se utilizó un procedimiento de carga de dos pasos. En primer lugar, se cargaron 200 µl de una solución en agua desionizada (DI) o PBS que contenía 0,8 mg, 1,6 mg, 2 mg u 8 mg de PVP:PVA y diversas cantidades de LNP (expresadas como masa de ARNm encapsulado), proteína o ADN y seco. Luego, se usó un volumen variable de PVP:PVA al 20 % p/p en agua DI o PBS para llevar la masa total de MNP a 40 mg de PVP:PVA. Esa solución de polímero se cargó y se secó para crear un respaldo de polímero delgado. Todos los MNP utilizados en estudios in vivo se fabricaron mediante dispensación manual a menos que se especifique lo contrario. Todos los MNP cargados con LNP, ADN o proteína se fabricaron aplicando vacío a través del molde utilizando el patrón con líneas a una presión manométrica de -1 bar y aplicando vacío en la cámara de secado a una presión manométrica de -0,6 bar.

Para el método de fabricación de un solo paso, los 40 mg de PVP:PVA se mezclaron con varias cantidades de proteína y se agregaron en un solo paso.

El tiempo necesario para cargar tinta en el molde negativo de PDMS se evaluó registrando la carga con un microscopio electrónico (n = 3). El microscopio se colocó en el costado del molde PMDS y se enfocó en las microagujas a través del PDMS transparente.

La solución de polímero se cargó en moldes de PDMS que se desgasificaron bajo varios valores de vacío de 0 a -0,5 bar de presión manométrica durante varios períodos de tiempo. La cantidad de tiempo entre la desgasificación y la carga varió de 5 a 10 min a 1 h. Luego, los MNP se secaron y se retiraron del molde PDMS. Se adquirieron imágenes ópticas de la solución de tinte de polímero que se movía hacia el molde de PDMS 0 min, 2 min, 5 min y 10 min después de agregar la solución al molde. A partir de estas imágenes, se estimó la altura de la aguja mediante análisis de imágenes.

Las soluciones de polímero (n = 1) se caracterizaron con un reómetro Discovery HR-2 de TA Instruments con una placa paralela de 40 mm y una rampa de velocidad de corte de 0,01 s−1 a 5000 s−1.

Las agujas de un MNP cargado con 50 µg, 100 µg o 200 µg de BSA y 0,8 mg, 4 mg u 8 mg de PVP:PVA (para la carga de la punta en dos pasos) se cortaron y disolvieron en agua DI (n = 6). Se utilizó un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Fisher Scientific) para cuantificar la carga de proteínas utilizando el procedimiento estándar para una placa de 96 pocillos. Se añadió un estándar interno de PVP y PVA a la curva de calibración para tener en cuenta su interferencia. La cantidad de PVP y PVA añadida a la curva de calibración se calculó en función del volumen de la aguja (0,08 mm3), una densidad de 1,2 g/cm3 y el número de agujas utilizadas para la cuantificación de BSA (ajustado a la dilución).

Para la comparación de la eficiencia de carga entre la fabricación manual y automatizada, se cortaron agujas de un MNP cargado con 100 µg de ADN y 1,6 mg de PVP:PVA (carga de punta en dos pasos) y se disolvieron en tampón Tris-EDTA (TE) (n = 8). El ADN se cuantificó usando absorción UV a 260 nm y 280 nm usando un NanoDrop. Debido a que PVP también absorbe en el rango UV, se agregó la misma cantidad de PVP a la curva de calibración para tener en cuenta su contribución. La cantidad de PVP a añadir se calculó de la misma manera que se describe en la cuantificación de proteínas y asumiendo una proporción de PVP a PVA de 1:1. Esto se repitió para el mapa de calor de la posición de la bandeja y el cálculo de la eficiencia de carga con ADN, pero se usaron 10 µg de ADN y 2 mg de PVP:PVA por parche.

Los ARNm purificados se obtuvieron con tapa CleanCap AG, sustitución completa de N1-metil-pseudouridina y cola poliadenilada (120 A) (TriLink BioTechnologies). Se utilizaron varios lípidos de alta pureza para la síntesis de LNP, incluidos 3,6-bis({4-[bis(2-hidroxidodecil)amino]butil})piperazina-2,5-diona (cKK-E12, Organix), heptadecano- 8-((2-hidroxietil)(8-noniloxi)-8-oxoctil)amino)octanoato de 9-ilo (Lipid 5, Organix), 1-2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE, Avanti), colesterol (Sigma-Aldrich) y 1-2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio) (C14-PEG2000, Avanti). Los LNP se prepararon utilizando los procedimientos descritos previamente34,35,36. Los lípidos se disolvieron en etanol en una proporción molar de 35:16:46,5:2,5 cKK-E12:DOPE:colesterol:C14-PEG2000 o 38,4:12,3:47,4:1,9 Lípido 5:DOPE:colesterol:C14-PEG2000 cuando se usaba cKK- E12 o Lípido 5 como el lípido ionizable, respectivamente. Para preparar los LNP, la solución etanoica se añadió rápidamente y se mezcló con una solución de ARNm tamponada con citrato a pH 3 en una proporción de volumen de 3:1 (acuosa:etanol). Cuando se usó cKKe12, la proporción en peso de lípidos ionizables a ARNm se estableció en 10, y la concentración final de ARNm fue de 0,1 mg ml−1. Cuando se usó el lípido 5, la proporción en peso de lípido ionizable a ARNm se fijó en 5 y la concentración final de ARNm fue de 0,135 mg ml−1. Todos los ácidos nucleicos se almacenaron a -80 °C y se dejaron descongelar en hielo antes de su uso. A continuación, los LNP se dializaron durante al menos 2 h en PBS a 4 °C en un casete de corte de peso molecular (MWCO) de 20 00034. Para los LNP en agua DI, la solución se dializó frente a agua DI durante un mínimo adicional de 2 h a 4 °C. Cuando fue necesario, los LNP se concentraron en un filtro Amicon mediante centrifugación a 3000 g42. Todas las soluciones se mantuvieron a 4 °C y se usaron en 1 semana.

La concentración de ARNm y la eficiencia de encapsulación en los LNP se estimó con un ensayo Quant-iT RiboGreen (Thermo Fisher Scientific) utilizando un procedimiento modificado descrito en otro lugar (n = 3 por lote)34. En resumen, los LNP se diluyeron en TE o TE mezclados con tampón Triton X-100 (TX). Luego, se utilizó el ensayo Quant-iT RiboGreen para cuantificar el ARNm que no está encapsulado (cuando se diluye con TE) y la concentración total de ARNm (cuando se diluye con TX). Para el tamaño, los LNP se diluyeron 200 veces en PBS y se caracterizaron usando un Zetasizer Nano-NS (Malvern Instruments). Al medir la carga de ARNm en MNP, se cortaron microagujas y se disolvieron en TE y TX. Al medir el ARNm cargado en el respaldo de MNP, se cortaron las microagujas y el MNP restante se disolvió en TE y TX. La sustracción del ARNm no encapsulado del ARNm total produjo la concentración de ARNm encapsulado.

Los polímeros se disolvieron en PBS o agua DI a una concentración que oscilaba entre el 10 % y el 30 % p/p dependiendo de su solubilidad (n = 4). A continuación, estas soluciones se pesaron y mezclaron con la suspensión de LNP para alcanzar la proporción de masa de polímero a ARNm adecuada. La mezcla de tinta se secó inmediatamente en un tubo LoBind Eppendorf en un desecador a -0,5 bar de vacío. Después de 24 h de secado, el sedimento de tinta se volvió a disolver en PBS y se incubó durante 10 min a 37 °C. Se usó PBS para ajustar el volumen de modo que 15 µl de tinta disuelta contengan 50 ng de ARNm encapsulado. Esta mezcla se usó para transfectar células. El lípido ionizable utilizado fue cKK-E12.

Para la evaluación in vitro de los MNP cargados con LNP, se fabricaron cuatro MNP utilizando la carga en dos pasos, 10 µg de ARNm y 8 mg de PVP:PVA para la carga en la punta. Se usaron dos MNP para cuantificar la carga de la punta de LNP y dos MNP para transfectar células HeLa. Las agujas se cortaron y disolvieron en 1 ml de tampón TE para la cuantificación de ARN y en 1 ml de DMEM para la transfección celular. Se usó el procedimiento descrito en la síntesis de LNP para cuantificar el ARNm y se transfectaron células HeLa como se describe a continuación. El lípido ionizable utilizado fue el Lípido 5.

Las células HeLa se cultivaron en DMEM con alto contenido de glucosa con rojo fenol (Invitrogen) suplementado con FBS al 10 % (Invitrogen) y antibiótico al 1 % (Invitrogen). Luego, se sembraron 10.000 células en pocillos de una placa blanca de 96 pocillos en medio de crecimiento completo. Veinte horas después de la siembra, se añadieron al medio de cultivo 15 µl de LNP frescos o formulación disuelta, o 50 µl de LNP frescos o MNP disueltos. En todos los casos, se añadieron a cada pocillo 50 ng de ARNm encapsulado. Veinticuatro horas después de la transfección, se añadieron 100 µl del reactivo Bright-Glo Luciferase Assay Kit (Promega) y se midió la luminiscencia en los siguientes 2 min utilizando un lector de placas Tecan Infinite 200 PRO.

La viabilidad de las células HeLa se midió en presencia de 0,6 mg de formulación polimérica y 50 ng de ARNm encapsulado en LNP preparados con cKK-e12 como lípido ionizable. Se usaron quince microlitros de tinta en cada pocillo. La viabilidad celular se midió en una placa de 96 pocillos utilizando un ensayo CKK8 como describe el fabricante (ab228554).

El MNP se fabricó usando la carga en dos pasos, usando 10 µg de ARNm y 8 mg de PVP:PVA en el primer paso. Cada una de las 100 agujas del MNP se cortó manualmente en su base bajo un microscopio y se clasificó según su posición en la matriz. El ARN se cuantificó de la misma manera que se describe en la sección de síntesis de LNP. El lípido ionizable utilizado fue el Lípido 5.

Se usaron ARNm-LNP de FLuc para todas las muestras. Los LNP se analizaron (1) después de la diálisis a PBS, (2) después de concentrar a 320 μg ml−1, (3) después de diluir a 200 μg ml−1 en una solución de polímero al 4 % p/p para formar tinta de vacuna y (4) después del secado para formar MNP. Las muestras se disolvieron en 20 µl, se agitaron con vórtex durante 2 s, se diluyeron con 200 µl adicionales y se mezclaron. Luego, se diluyeron 10 µl de mRNA-LNP reconstituidos en 490 µl de agua, se agitaron durante 2 s y luego se analizaron mediante dispersión de luz dinámica (DLS) en un Zetasizer Nano-NS (Malvern Instruments). Las muestras (n = 5 por grupo) se equilibraron durante 60 s antes de la medición. Se realizaron tres repeticiones técnicas para cada muestra.

Se usaron ARNm-LNP de FLuc para todas las muestras. Los LNP se analizaron (1) después de la diálisis a PBS (2), después de concentrar a 320 μg ml−1 (3), después de diluir a 200 μg ml−1 en una solución de polímero al 4 % p/p para formar tinta de vacuna y (4) después del secado para formar MNP. Las muestras disueltas se agregaron a las rejillas TEM de cobre recubiertas de carbono y se secaron para eliminar el exceso de solución. A continuación, las muestras se tiñeron usando una solución acuosa de ácido fosfotúngstico al 1%; se eliminó el exceso de solución colorante; y las muestras se secaron a temperatura ambiente antes de la formación de imágenes TEM. Para la obtención de imágenes criogénicas-TEM, las muestras se congelaron por inmersión utilizando un 930 Gatan Cryoplunge 3. Todas las muestras se obtuvieron mediante un microscopio JEOL 2100 FEG a un voltaje de aceleración de 200 kV.

Se usaron ARNm-LNP de FLuc para todas las muestras. El ARNm se analizó (1) según lo proporcionado por el fabricante, (2) después de la síntesis de ARNm-LNP y la diálisis a PBS, (3) después de diluir a 200 μg ml−1 en una solución de polímero al 4 % p/p para formar la tinta de la vacuna y ( 4) después del secado para formar MNP. Luego, se analizaron 2 µl de las muestras disueltas usando un Agilent Femto Pulse usando el Ultra Sensitivity RNA Kit (FP-1201). Las muestras se prepararon utilizando tampón TE o TX.

El contenido de agua de los MNP fabricados en diferentes momentos y etapas de secado se cuantificó mediante análisis termogravimétrico (TGA) utilizando un analizador termogravimétrico Pyris 1 (PerkinElmer) con una velocidad de calentamiento de 20 °C por minuto desde 50 °C a 600 °C bajo flujo de nitrógeno (20 ml min−1) (n = 3). El contenido de agua se evaluó analizando solo las agujas de las MNP colocadas en bandejas de cerámica y no el respaldo. La velocidad de secado se estimó utilizando una regresión lineal del contenido de agua medido a lo largo del tiempo durante el proceso de secado. Todos los análisis se realizaron por triplicado.

Para la prueba de compresión, se montó un solo MNP entre placas de compresión (serie Instron 2501) y se comprimió a una velocidad de 1 mm min−1 usando un Instron 5943 con una celda de carga de 500 N (n = 10). Se informó la fuerza máxima antes del fallo de la microaguja y la pendiente de la región lineal de compresión inicial. El modo de fallo de las microagujas se determinó mediante la obtención de imágenes de los parches después de la prueba.

Los MNP se aplicaron ex vivo en piel de cerdo extirpada utilizando un mini aplicador con resorte (Micropoint Technologies) durante 2 min, 5 min, 10 min o 30 min (n = 3). Posteriormente, las muestras de piel se fijaron en formalina durante 48 h y luego se transfirieron a etanol al 70 % y se incluyeron en cera de parafina. Las muestras fueron seccionadas y teñidas con hematoxilina y eosina.

Para cuantificar la disolución de microagujas en función del tiempo de aplicación, se tomaron imágenes de parches de microagujas antes y después de la aplicación en piel de cerdo extirpada utilizando un Leica DFC450. Los parches se colocaron de manera transversal para obtener imágenes utilizando el software LAS versión 4.7. La longitud de las microagujas se calculó utilizando ImageJ para al menos 10 microagujas de cada parche, y estas mediciones se realizaron en tres parches por punto de tiempo.

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados y realizados bajo las pautas del Comité de Cuidado de Animales del Instituto Tecnológico de Massachusetts (1019-061-22). Se usaron ratones hembra C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad (Charles River Laboratories) y se controló su seguridad (n = 5). Los MNP se fabricaron con mRNA-LNP que codifican FLuc (L-7010, TriLink BioTechnologies) utilizando el método de carga de dos pasos descrito anteriormente. Se variaron la dosis de LNP y la química de lípidos ionizables, manteniendo al menos una relación de masa de polímero:mRNA de al menos 100:1. Se estudiaron dos lípidos ionizables que se seleccionaron previamente para métodos de administración de ARNm IV o IM, respectivamente: cKK-E12 (ref. 34) y Lipid 5 (ref. 35). Los MNP se aplicaron a cualquiera de las almohadillas con anestesia. Para disolver más completamente la dosis completa de LNP transportada en un MNP, cuando se aplicó una matriz de 10 × 10, los MNP se dividieron en dos mitades y se aplicaron consecutivamente a la misma almohadilla para la pata, durante 10 min por mitad. Se aplicó presión con la mano durante el primer minuto y luego se aseguró el MNP a la almohadilla del pie con cinta adhesiva durante los 9 minutos restantes. Como control positivo, se administraron LNP al músculo caudal del muslo como una suspensión de 40 µl en PBS en dosis equivalentes. Se seleccionó la almohadilla plantar porque se había utilizado anteriormente para imágenes IVIS de luminiscencia después de la aplicación de microagujas37 y porque es un sitio bien estudiado para la administración ID de vacunas, lo que permite el aislamiento del ganglio linfático de drenaje62,63.

Veinticuatro horas después de la aplicación de MNP, se obtuvieron imágenes de bioluminiscencia de los ratones en un sistema de formación de imágenes cinéticas IVIS (PerkinElmer). Luego, 15 minutos antes de la toma de imágenes, se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal RediJect D-Luciferin Ultra (PerkinElmer) a 150 mg kg−1. La luminiscencia se cuantificó utilizando el software LivingImage (PerkinElmer). La comparación entre los resultados de luminiscencia debe considerarse cuidadosamente porque la absorción, la difusión y la profundidad de aplicación de la luz en el lugar de la inyección pueden afectar la señal medida con IVIS. Para el experimento de cinética, se realizaron imágenes a las 2 h, 6 h, 24 h, 48 h y 72 h después de la administración.

En total, se sembraron 89 000 células HEK293 por pocillo de un portaobjetos de cultivo de cuatro pocillos BioCoat Poly-D-Lysine (354577). Se utilizó el mismo medio de crecimiento que las células HeLa. Veinticuatro horas después de la siembra, las células se transfectaron con 265 ng de ARNm por pocillo a partir de una suspensión de LNP preparada con lípido 5 y ARNm encapsulante que codifica RBD. Los LNP disueltos de un MNP también se usaron para demostrar la bioactividad después de cargarlos en los MNP. Se utilizó el mismo MNP que el utilizado en el estudio de vacunación contra el SARS-CoV-2. Se cortaron agujas, se disolvieron en DMEM y se usaron para transfectar células usando la misma masa de ARNm que la suspensión de LNP de control. El ARNm se cuantificó disolviendo agujas de una réplica independiente del MNP en tampón TE y usando el procedimiento descrito en la síntesis de LNP (también se agregaron PVP y PVA como estándares internos a la curva de calibración de ARN del RiboGreen). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, las células se lavaron dos veces con PBS a 37 °C. Las células se lavaron con PBS entre todos los pasos posteriores. Las células se dejaron equilibrar a temperatura ambiente durante 15 min. Luego, se añadió 1 ml de solución fijadora Image-iT (Invitrogen) por pocillo (FB002) y se dejó durante 15 min. A continuación, se añadió 1 mL de eBioscience Intracelular Fixation and Permeabilization Buffer (Invitrogen) y se dejó incubar durante 10 min. Luego, se añadió 1 ml de BSA al 1% (p:v) en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron a cada pocillo 300 µl de anticuerpo monoclonal humano recombinante (T01KHu, Thermo Fisher Scientific, 703958) de SARS-CoV-2 Spike Protein (RBD) diluido 100 veces en PBS y se dejó incubar durante 1 h. Se usó PBS-Tween para lavar las células. A continuación, 300 µl de anticuerpo secundario de adsorción cruzada anti-IgG humana (H+L) de cabra, Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific, A-11013), diluido 400 veces en PBS, se usó como anticuerpo secundario y se incubó durante 1 H. Luego, se usaron 300 µl de tinción de rodamina-faloidina (Invitrogen R415) diluidos 400 veces en BSA al 1 % para obtener imágenes del citoesqueleto celular y se incubaron durante 30 min. Finalmente, las células se fijaron usando una gota de DAPI ProLong (Invitrogen, P36982). Se tomaron imágenes de las células en un microscopio confocal (Olympus FV1000).

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados y realizados bajo las pautas del Comité de Cuidado de Animales del Instituto Tecnológico de Massachusetts (1019-061-22). Se usaron ratones hembra C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad (Charles River Laboratories) y se controló su seguridad (n = 5). Los MNP se fabricaron con mRNA-LNP optimizados por codones humanos que codifican SARS-CoV-2 RBD y un motivo de trimerización de T4, utilizando el método de carga de dos pasos descrito anteriormente. Se fabricaron matrices de MNP más pequeñas que contenían 1,5 µg de ARNm encapsulado, que se verificó mediante cuantificación de ARNm. Se aplicaron cuatro MNP con aproximadamente 12 microagujas en la almohadilla plantar izquierda y derecha de ratones con anestesia, con un tiempo de aplicación de 10 minutos para cada uno, para una dosis total de ARNm encapsulado de 6,0 µg por ratón. Se aplicó presión con la mano durante el primer minuto y luego se aseguró el MNP a la almohadilla del pie con cinta adhesiva durante los 9 minutos restantes. Como control positivo, se administraron LNP al músculo del muslo caudal derecho como una suspensión de 40 µl en PBS a 10,0 µg de ARNm encapsulado por ratón.

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados y realizados bajo las pautas del Comité de Cuidado de Animales del Instituto Tecnológico de Massachusetts (1019-061-22). Los MNP se fabricaron con LNP de ARNm de FLuc utilizando el método de carga de dos pasos descrito anteriormente, a una dosis de ARNm de 1,0 µg por parche con una proporción de masa de polímero:ARNm de 500:1. El lípido 5 se utilizó como lípido ionizable. El tamaño y la aplicación de MNP son idénticos a los estudios anteriores de expresión de fLuc (n = 5). Los MNP se almacenaron en un recipiente con desecante de sílice a varias temperaturas. Como control positivo, se almacenaron viales sellados de suspensión que contenían la misma cantidad de ARNm de fLuc en LNP hechos con lípido 5 a varias temperaturas junto con MNP.

Se utilizó un kit de detección ELISA SARS-CoV-2 Spike S1-RBD (L00845, GenScript). Las placas se recubrieron con antígeno recombinante purificado SARS-CoV-2 Spike S1-RBD. Las placas se incubaron con diluciones en serie de sueros inactivados por calor y se incubaron a 37 °C durante 30 min. Se utilizó una dilución 1:10.000 de conjugado de peroxidasa de rábano picante-IgG anti-ratón de conejo (Abcam, ab6728) como anticuerpo secundario y 3,5,3',5'-tetrametilbencidina (TMB) como sustrato. Los títulos de punto final interpolados se calcularon como la dilución que emitió una densidad óptica superior a 3 veces el fondo producido por el suero de ratones ingenuos.

Se diseñaron y produjeron placas ECLA (Meso Scale Discovery SARS-CoV-2 IgG, N05CA-1, Panel 7) con cuatro puntos de antígeno en cada pocillo. Los antígenos incluidos fueron WA1/2020, B.1.1.7, P.1 y B.1.351 S1-RBD. Las placas se bloquearon con 50 µl de solución de BSA al 1 % durante al menos 30 min a temperatura ambiente con agitación a 700 rpm. Durante el bloqueo, el suero se diluyó 1:5000 con Diluent 100 (Meso Scale Discovery). Las placas se lavaron con 150 µl de tampón de lavado y se secaron, y se añadieron 50 µl de muestras diluidas por duplicado a las placas. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente con agitación a 700 rpm durante 2 h. El anticuerpo secundario se preparó utilizando el anticuerpo de detección de IgG anti-ratón de conejo de Jackson ImmunoResearch (315-005-045) conjugado con MSD GOLD SULFO-TAG por química NHS-Ester según las pautas del fabricante (R91AO-1). Las placas se lavaron de nuevo tres veces y se añadieron a cada pocillo 50 µl de anticuerpo de detección de IgG anti-ratón marcado con SULFO diluido a 1x en Diluyente 100 y se incubaron durante 1 h con agitación a 700 rpm. Las placas se lavaron tres veces; Se añadieron 150 µl de MSD GOLD Read Buffer B a cada pocillo; y las placas se leyeron en un MESO Quick-Plex SQ 120. Los títulos de MSD para cada muestra se informaron como unidades relativas de luz (RLU), que se calcularon como muestra menos blanco para cada punto y muestra. El límite de detección se definió como 500 RLU para todos los ensayos.

Los MNP que contenían 1,5 μg de ARNm de SARS-CoV-2 encapsulado se almacenaron en un recipiente con desecante de sílice a varias temperaturas. Como control positivo, los viales sellados de suspensión que contenían mRNA-LNP de SARS-CoV-2 a 200 µg ml-1 se almacenaron a varias temperaturas junto con MNP. Se usaron ratones BALB/c hembra de seis a ocho semanas de edad (Charles River Laboratories) y se controló su seguridad (n = 5). Todos los ratones recibieron una dosis inicial de 10 µg de ARNm encapsulado en mRNA-LNP administrados al músculo del muslo caudal derecho como una suspensión de 40 µl en PBS. A continuación, los ratones se reforzaron con varios materiales, incluidos controles frescos y parches o suspensiones almacenadas durante 1 mes o 3 meses. Para los grupos de MNP, como en experimentos anteriores, se aplicaron cuatro MNP con 12 microagujas a la almohadilla de la pata izquierda y derecha de los ratones con anestesia, con un tiempo de aplicación de 10 minutos para cada uno, para una dosis total estimada de ARNm de 6,0 μg por ratón. Para los grupos IM, se administraron 4 μg de ARNm encapsulado en ARNm-LNP al músculo del muslo caudal derecho como una suspensión de 40 μl en PBS.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism. Los valores de P están representados por: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos generados y analizados durante estos estudios están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. La secuencia RBD utilizada para este estudio está disponible en GenBank (OP839194).

Los códigos utilizados para el modelado de rendimiento y la programación de dispositivos están disponibles en un repositorio público de Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7735167).

Khan, MI, Ikram, A. & Hamza, HB Capacidad de fabricación de vacunas en países de ingresos bajos y medianos. Toro. Órgano Mundial de la Salud. 99, 479–479A (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Koff, WC et al. Desarrollo y despliegue de vacunas COVID-19 para los más vulnerables. ciencia Traducir Medicina. 13, eabd1525 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wells, CR & Galvani, AP El impacto global de la cobertura de vacunación desproporcionada en la mortalidad por COVID-19. Lanceta Infectada. Dis. 22, 1254–1255 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kakule, B., Lubukayi, N., Muhindo, E., Janoch E. & Prather A. En la última milla: vacunas COVID-19 en la República Democrática del Congo (CARE International, 2022); https://careevaluaciones.org/wp-content/uploads/COVID-19-vaccines-in-Democratic-Republic-of-the-Congo-April-2022.pdf

O'Shea, J., Prausnitz, MR y Rouphael, N. Parches de microagujas solubles para permitir un mayor acceso a las vacunas contra el SARS-CoV-2 y futuros brotes pandémicos. Vacunas (Basilea) 9, 320 (2021).

Artículo PubMed Google Académico

Sullivan, SP, Murthy, N. & Prausnitz, MR Entrega de proteína mínimamente invasiva con microagujas de polímero de disolución rápida. Adv. Mate. 20, 933–938 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sullivan, SP et al. Parches de microagujas de polímero en disolución para la vacunación contra la influenza. Nat. Medicina. 16, 915–920 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, YC, Park, JH & Prausnitz, MR Microagujas para la administración de fármacos y vacunas. Adv. Entrega de drogas Rev. 64, 1547–1568 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mistilis, MJ et al. Estabilidad a largo plazo de la vacuna contra la influenza en un parche de microagujas que se disuelve. Entrega de drogas Traducir Res. 7, 195–205 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gill, HS, Denson, DD, Burris, BA y Prausnitz, MR Efecto del diseño de microagujas sobre el dolor en sujetos humanos. clin. J. Pain 24, 585–594 (2008).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Rodgers, AM, Cordeiro, AS & Donnelly, RF Actualización tecnológica: parches de microagujas solubles para la administración de vacunas. Medicina. Dispositivos (Auckl). 12, 379–398 (2019).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Noh, I., Lee, K. & Rhee, YS Sistemas de microagujas para administrar fármacos de ácido nucleico. J. Pharm. investigando 52, 273–292 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koh, KJ et al. Formulación, caracterización y evaluación de microagujas poliméricas solubles cargadas con ARNm (RNApatch). Sci Rep. 8, 11842 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Golombek, S. et al. Entrega intradérmica de ARNm sintético utilizando microagujas huecas para la producción eficiente y rápida de proteínas exógenas en la piel. mol. El r. Ácidos nucleicos. 11, 382–392 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Creelman, B., Frivold, C., Jessup, S., Saxon, G. y Jarrahian, C. Evaluación de la preparación para la fabricación para la evaluación de la industria de parches de matriz de microagujas: una exploración de las barreras para la fabricación a gran escala. Entrega de drogas Traducir Res. 12, 368–375 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Moga, KA et al. Parches de microagujas que se disuelven rápidamente a través de un enfoque de litografía suave altamente escalable y reproducible. Adv. Mate. 25, 5060–5066 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fakhraei Lahiji, S. et al. Efectos de la disolución de los parámetros de fabricación de microagujas sobre la actividad de la lisozima encapsulada. EUR. J. Pharm. ciencia 117, 290–296 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Markarian, J. Fabricación de parches de matriz de microagujas para la administración de vacunas. Farmacia Tecnología 44, 31–32 (2020).

Google Académico

Dalví, M. et al. Panorama de la disolución de microagujas para la administración transdérmica de fármacos. Ciencias de la vida 284, 119877 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Du, G. & Sun, X. Avances actuales en microagujas de liberación sostenida. farmacéutico. Frentes 2, e11–e22 (2020).

Artículo Google Académico

Chen, W. et al. Parches de matriz de microagujas cargados con partículas dobles de proteínas/péptidos mineralizadas para el tratamiento de la diabetes tipo 2. Nat. común 8, 1777 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zhao, H. et al. Moldeo de réplicas de alta fidelidad de microestructuras de polímero cristalino líquido vítreo. Aplicación ACS. Mate. Interfaces 8, 8110–8117 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Indermun, S. et al. Avances actuales en la fabricación de microagujas para administración transdérmica. J.Control. Comunicado 185, 130–138 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Daly, R., Harrington, TS, Martin, GD & Hutchings, IM Impresión de inyección de tinta para productos farmacéuticos: una revisión de la investigación y la fabricación. En t. J. Pharm. 494, 554–567 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Boehm, RD, Miller, PR, Schell, WA, Perfect, JR y Narayan, RJ Impresión de inyección de tinta de anfotericina B en microagujas biodegradables mediante impresión de inyección de tinta piezoeléctrica. JOM 65, 525–533 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Economidou, SN et al. Parches de microagujas impresos en 3D utilizando estereolitografía (SLA) para la administración de insulina intradérmica. Mate. ciencia Ing. C Biol. aplicación 102, 743–755 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Caudill, C. et al. La vacunación transdérmica a través de microagujas impresas en 3D induce una potente inmunidad humoral y celular. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 118, e2102595118 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Elahpour, N. et al. Microagujas impresas en 3D para la administración transdérmica de fármacos: una breve revisión de dos décadas. En t. J. Pharm. 597, 120301 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Xu, L., Lee, H., Jetta, D. & Oh, KW Microfluidos sin energía accionados por vacío que utilizan la solubilidad o permeabilidad del gas del polidimetilsiloxano (PDMS). Ficha de laboratorio 15, 3962–3979 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Yang, S. et al. Un proceso de fabricación escalable de microagujas de polímero. En t. J. Nanomedicina. 7, 1415–1422 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Nejad, HR, Sadeqi, A., Kiaee, G. y Sonkusale, S. Fabricación de microagujas de bajo costo y sin sala limpia. Microsistema Nanoeng. 4, 17073 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Fukushima, K. et al. Microagujas de disolución de dos capas para la administración percutánea de fármacos peptídicos/proteicos en ratas. Farmacia Res. 28, 7–21 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Schoenmaker, L. et al. Vacunas COVID-19 de nanopartículas lipídicas de ARNm: estructura y estabilidad. En t. J. Pharm. 601, 120586 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fenton, OS et al. Materiales de nanopartículas lipídicas personalizables para la entrega de siRNA y mRNA. Angew. química En t. ed. ingl. 57, 13582–13586 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hasset, KJ et al. Optimización de nanopartículas lipídicas para la administración intramuscular de vacunas de ARNm. mol. El r. Ácidos nucleicos. 15, 1–11 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sabnis, S. et al. Serie de lípidos amino para la entrega de ARNm: escape endosomal mejorado y farmacología y seguridad sostenidas en primates no humanos. mol. El r. 26, 1509–1519 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

González-González, E. et al. Silenciamiento de la expresión del gen reportero en la piel usando ARNsi y expresión de ADN plasmídico administrado por un dispositivo de matriz de protrusión soluble (PAD). mol. El r. 18, 1667–1674 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, W., Li, S., Fan, X. & Prausnitz, MR Diseños de parches de microagujas para aumentar la dosis administrada a sujetos humanos. J.Control. Versión 339, 350–360 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Davis, SP, Landis, BJ, Adams, ZH, Allen, MG y Prausnitz, MR Inserción de microagujas en la piel: medición y predicción de la fuerza de inserción y la fuerza de fractura de la aguja. J. Biomech. 37, 1155–1163 (2004).

Artículo PubMed Google Académico

Aoyagi, S., Izumi, H. y Fukuda, M. Aguja de polímero biodegradable con varios ángulos de punta y consideración sobre el mecanismo de inserción de la probóscide del mosquito. Sens. Actuadores A Phys. 143, 20–28 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Walsh, EE y col. Seguridad e inmunogenicidad de dos vacunas candidatas contra el covid-19 basadas en ARN. N. ingl. J.Med. 383, 2439–2450 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mihaila, R. et al. Purificación de nanopartículas de lípidos mediante centrifugación por centrifugación-diálisis (SCD): un enfoque fácil y de alto rendimiento para la preparación a pequeña escala de complejos de siRNA-lípidos. En t. J. Pharm. 420, 118–121 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Corbett, KS y col. Diseño de vacuna de ARNm de SARS-CoV-2 habilitado por preparación de prototipo de patógeno. Naturaleza 586, 567–571 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gebre, MS et al. Las vacunas de ARNm inducen respuestas rápidas de anticuerpos en ratones. Vacunas NPJ 7, 88 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, J. et al. Protección de la vacuna de ADN contra el SARS-CoV-2 en macacos rhesus. Ciencia 369, 806–811 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fenton, OS et al. Síntesis y evaluación biológica de materiales lipídicos ionizables para la entrega in vivo de ARN mensajero a linfocitos B. Adv. Mate. 29, https://doi.org/10.1002/adma.201606944 (2017).

Zhang, H., Leal, J., Soto, MR, Smyth, HDC y Ghosh, D. Nanopartículas de lípidos aerosolizables para la administración pulmonar de ARNm mediante el diseño de experimentos. Farmacia. 12, 1042 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, X. et al. La cinética rápida para alcanzar el pico de anticuerpos séricos se logra después de la vacunación contra la influenza mediante microproyecciones en la piel densamente empaquetadas y recubiertas en seco. J.Control. Versión 158, 78–84 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Quan, F.-S. et al. La vacunación intradérmica con partículas similares al virus de la influenza mediante el uso de microagujas induce una protección superior a la de la inmunización intramuscular. J.Virol. 84, 7760–7769 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stewart-Jones, GBE et al. Desarrollo de vacunas de ARNm de SARS-CoV-2 que codifican dominios de unión al receptor y N-terminal de pico. Preimpresión en bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.10.07.511319 (2022).

Beals, CR et al. Respuesta inmunitaria y reactogenicidad de la administración intradérmica frente a la administración subcutánea de la vacuna contra el virus de la varicela zóster: un ensayo exploratorio, aleatorizado y parcialmente ciego. Lanceta Infectada. Dis. 16, 915–922 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Levin, Y., Kochba, E., Hung, I. y Kenney, R. Vacunación intradérmica con el novedoso dispositivo de microagujas MicronJet600: pasado, presente y futuro. Tararear. Vacunas Immunother. 11, 991–997 (2015).

Artículo Google Académico

Organización Mundial de la Salud. Reunión del Grupo de Expertos en Asesoramiento Estratégico sobre inmunización, abril de 2012: conclusiones y recomendaciones. Epidemiol semanal. rec. 87, 201–216 (2012).

Google Académico

Dey, A. et al. Potencial inmunogénico del candidato a vacuna de ADN, ZyCoV-D contra el SARS-CoV-2 en modelos animales. Vacuna. 39, 4108–4116 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Massinga Loembé, M. & Nkengasong, JN Acceso a la vacuna COVID-19 en África: distribución global, plataformas de vacunas y desafíos futuros. Inmunidad 54, 1353–1362 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Crommelin, DJA, Anchordoquy, TJ, Volkin, DB, Jiskoot, W. & Mastrobattista, E. Abordar la fría realidad de la estabilidad de la vacuna de ARNm. J. Pharm. ciencia 110, 997–1001 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kuwentrai, C. et al. Entrega intradérmica del dominio de unión al receptor de la proteína de pico SARS-CoV-2 con microagujas solubles para inducir respuestas humorales y celulares en ratones. Bioing. Traducir Medicina. 6, e10202 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zhao, P. et al. Almacenamiento a largo plazo de nanopartículas similares a lípidos para la entrega de ARNm. Bioact. Mate. 5, 358–363 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Ball, R., Bajaj, P. & Whitehead, K. Cómo lograr la estabilidad a largo plazo de las nanopartículas lipídicas: examinar el efecto del pH, la temperatura y la liofilización. En t. J. Nanomedicina. 12, 305–315 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Las enfermedades infecciosas de Lancet. Es hora de que África esté preparada para el futuro, comenzando con COVID-19. Lanceta. Infectar. Dis. 22, 151 (2022).

ARNm fabricado en África. Nat. Biotecnología. 40, 284 (2022).

Maloy, KJ, Donachie, AM, O'Hagan, DT y Mowat, AM Inducción de respuestas inmunitarias mucosas y sistémicas mediante la inmunización con ovoalbúmina atrapada en micropartículas de poli(lactida-co-glicolida). Inmunología 81, 661–667 (1994).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Zhang, YN et al. El tamaño de las nanopartículas influye en la retención y presentación de antígenos en los folículos de los ganglios linfáticos para la inmunidad humoral. Nano Lett. 19, 7226–7235 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Descargar referencias

Agradecemos a Meso Scale Discovery por sus generosos consejos, asistencia y reactivos. Agradecemos al Centro de Biotecnología Robert A. Swanson (1969) del Instituto Koch (RRID: SCR_018674) por el soporte técnico, específicamente el núcleo de Histología, el núcleo de Materiales de Nanotecnología, el BioMicroCenter y las instalaciones de Pruebas Preclínicas e Imágenes de Animales. Agradecemos al Laboratorio de Materiales de Ingeniería del Departamento de Ciencia e Ingeniería de Materiales del MIT por su apoyo técnico. Este trabajo fue financiado, en parte, por la subvención P30-CA14051 de apoyo (básico) del Instituto Koch del Instituto Nacional del Cáncer. Este trabajo también fue apoyado por la subvención DHHS/OS/ASPR/BARDA/DRIVe EZ-BAA-18-100-SOL-00018 de la Autoridad de Investigación y Desarrollo Biomédico Avanzado (BARDA). AVS es un beneficiario de la beca y quisiera agradecer a la Fundación Educativa Belga Estadounidense (BAEF) y Wallonia-Brussels International por la Beca de Excelencia (WBI.World). MK es un beneficiario de una beca y quisiera agradecer a la Fundación Bodossaki y la Fundación Onassis. Reconocemos el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (T32 AI0073787) a LHT

Estos autores contribuyeron igualmente: Aurélien vander Straeten, Morteza Sarmadi, John L. Daristotle.

Instituto David H. Koch para la Investigación Integral del Cáncer, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Aurélien vander Straeten, Morteza Sarmadi, John L. Daristotle, Maria Kanelli, Joe Collins, Apurva Pardeshi, Jooli Han, Dhruv Varshney, Behnaz Eshaghi, Johnny Garcia, Timothy A. Forster, Gary Li, Nandita Menon, Shahad K. Alsaiari, Robert Langer y Ana Jaklenec

Centro de Virología e Investigación de Vacunas, Centro Médico Beth Israel Deaconess, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Lisa H. Tostanoski, Catherine Jacob-Dolan, Olivia C. Powers, Kevin Hall y Dan H. Barouch

Departamento de Ingeniería Química, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Sydney L. Pyon, Linzixuan Zhang y Robert Langer

Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Catherine Jacob-Dolan y Dan H. Barouch

Instituto Ragon de MGH, MIT y Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Catherine Jacob-Dolan y Dan H. Barouch

Laboratorio de Ingeniería Macromolecular, Departamento de Ingeniería Mecánica y de Procesos, ETH Zurich, Zurich, Suiza

Morris Wolf y Mark W. Tibbitt

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Conceptualización: AVS, MS, JD, MK, JC, AJ y RF Metodología: AVS, MS, JD, MK, LT, JC, AP, DV, BE, JG, TF, GL, NM, CJD, SL, LZ, OP , KH, SA y MW Investigación: AVS, MS, JD, MK, LT, JC, AP, DV, BE, JG, TF, GL, NM, SP, CJD, SL, LZ, OP, KH y MW Visualización: AVS , MS, JD y JH Adquisición de fondos: AJ, RL, AVS y MK Administración del proyecto: AVS, JD, JC y AJ Supervisión: AJ, RL, DB y MT Redacción: borrador original: AVS, MS y JD Redacción: revisión y edición : AVS, MS, JD, LT, JH, RF, DB, RL y AJ

Correspondencia a Robert Langer o Ana Jaklenec.

Para obtener una lista de las entidades con las que RL está involucrado, con o sin compensación, consulte www.dropbox.com/s/yc3xqb5s8s94v7x/Rev Langer COI.pdf?dl=0. Para obtener una lista de entidades con las que AJ está involucrado, con o sin compensación, consulte https://www.dropbox.com/s/wre16lh7jr7bvoi/230410%20Jaklenec%20COI.pdf?dl=0. AVS, MS, JD, MK, JC, RL y AJ se nombran como inventores en una solicitud de patente pendiente (17/903586) relacionada con la tecnología descrita. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Biotechnology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Consultor independiente: Robert Farra.

( a ) Carga en el molde de microagujas negativo basado en la permeabilidad al aire de PDMS seguido de secado de la solución de polímero. Se aplica vacío debajo de la hoja de PDMS para eliminar el aire de debajo de la tinta de la vacuna a través del molde de PDMS permeable al aire. El secado se acelera aplicando también vacío sobre el molde. (b) Carga en el molde de microagujas negativo basado en la solubilidad en aire de PDMS seguido de secado de la solución de polímero. (c) Configuraciones de dispositivos de vacío para aplicar vacío al fondo del molde PDMS. ( d ) Tiempo de carga de la solución de polímero para PDMS hecho de diferentes proporciones de polímero a reticulante (n = 3 muestras independientes). Se utilizó un ANOVA ordinario de una vía (prueba de comparaciones múltiples de Sidak). ( e ) Imágenes de MNP de moldes PDMS que se desgasificaron bajo varios valores de vacío y se cargaron con solución de polímero. ( f ) Imágenes de MNP donde la solución de polímero se agregó al molde de PDMS desgasificado después de 5 a 10 minutos o 1 hora. ( g – h ) Progresión de la altura de la aguja a lo largo del tiempo después de dispensar la solución de polímero (n = 13–18 agujas individuales). ( i – j ) Altura de aguja normalizada a partir de imágenes después de varias condiciones de desgasificación (n = 10–18 agujas individuales). ( k ) Viscosidad medida para varias soluciones de polímero utilizadas en este estudio (n = 1). Los datos representan la media ± sd Los valores de P están representados por: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. MPa, megapascales; NS, no significativo.

(a) Imágenes de MNP hechas a partir de varios volúmenes de solución de PVP:PVA al 20% p/p, que minimizan el desperdicio de vacunas con un respaldo ultrafino. Las soluciones de PVP:PVA al 20% p/p se colorearon con cristal violeta. ( b – c ) Las imágenes de optimización del volumen de dispensación y la medición de la circularidad del respaldo seco resultaron de varias formulaciones de matriz MNP (n = 1).

(a) Diseño CAD de las piezas de acrílico que se cortaron y montaron para formar la estación de carga. Fotografías de (b) la estación de carga, (c) la cubierta superior de la estación de secado, (d) el positivo de MNP de 5×5 y (e) la lámina de PDMS de 5×5 de moldes negativos de MNP. (f) Una fotografía del sistema MVP con características anotadas. (g) Esquema que representa el sistema de dispensación y la altura de dispensación. Efecto de los parámetros de dosificación caudal (h), filtración (i), tamaño de la aguja (j) y altura de dosificación (k) sobre el tamaño de gota resultante. Todas las diferencias son significativas a (P < 0,01) a menos que se indique lo contrario. Se utilizó un ANOVA ordinario de una vía (prueba de comparaciones múltiples de Sidak) (n = 3 MNP por grupo). (l) Una imagen de 100 MNP dispensados ​​y secados en una bandeja de impresión. Los datos representan la media ± sd *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. NS, no significativo.

(a) Esquema de los procesos utilizados para (a) carga en un solo paso y (b) carga en la punta en dos pasos. Primero se dispensa una solución que contiene la vacuna y el polímero usando un brazo robótico sobre el molde PDMS. Simultáneamente, se aplica un vacío de -1 bar por debajo para cargar la solución en el molde negativo. Luego, la solución se seca bajo una atmósfera desecante y un vacío de -0,6 bar. Para la carga en un solo paso (a), la vacuna y suficiente polímero para formar las puntas y el soporte se depositan en un solo paso. Para la carga de la punta en dos pasos (b), la vacuna y el polímero se depositan primero solo en las puntas y luego se repite el mismo procedimiento usando solo el polímero para formar el respaldo de las MNP. (c) Caracterización de microagujas afiladas de longitud completa, correctamente formadas, fabricadas por el MVP automatizado, como porcentaje del total de agujas producidas (n = 30 parches). Los MNP fabricados tenían un promedio de 37 ± 8 agujas por parche. (d) El rendimiento de dispensación es una función de la altura de la gota dispensada y el tamaño del parche, mientras que (e) el rendimiento de secado es una función del tiempo de secado y el número de agujas por parche. Ambos rendimientos son funciones de (f) el tiempo de secado y (g) el tamaño del parche. El paso con el rendimiento más bajo determina el rendimiento general de la impresora de vacunas con microagujas.

(a) El rendimiento de la fabricación automatizada de MNP se puede aumentar mediante el movimiento modular de bandejas de moldes de MNP a una rejilla de secado para acelerar el paso de secado de vacunas. La aplicación de vacío para llenar el molde de microagujas se puede realizar en el dispositivo de transporte del molde (centro) o en el bastidor de la bandeja (derecha). (b) El rendimiento de secado se presenta en función de la longitud de la bandeja y el número de bandejas en la rejilla de secado vertical. El tamaño (h) de la rejilla de secado se estimó asumiendo una sola bandeja de 50 mm de altura. Al igual que el dispositivo de una sola bandeja, se supone que el tiempo de secado es de 48 h. (c) Los moldes de PDMS se pueden pretratar con una técnica de desgasificación usando presión negativa antes de dispensar la vacuna para un proceso de fabricación acelerado de MNP. Con moldes de PDMS desgasificados, un brazo robótico puede dispensar solución de vacuna de manera continua. Los moldes de PDMS totalmente dispensados ​​se pueden mover a una rejilla de secado mediante una cinta transportadora. Todo este proceso estará contenido dentro de un recinto aséptico para mantener la esterilidad durante el procesamiento. (d-i) Diseño para desmoldeo de parches automatizado. (d) Después de que los parches de microagujas de la vacuna se secan por completo en un molde PDMS, (e) un brazo robótico trae un respaldo acrílico con cinta adhesiva de doble cara. (f) El brazo robótico se alinea y une el respaldo adhesivo acrílico a un parche de microagujas, (g) y el MNP se retira del molde PDMS a medida que el brazo robótico se eleva verticalmente. (h) La punta del brazo robótico entra entre una ranura de metal diseñada para la eliminación de MNP. A medida que el brazo robótico se eleva verticalmente, el MNP se separa de la punta del brazo robótico y cae en su empaque (i), donde el MNP se cierne para evitar cualquier contacto directo con las puntas de las agujas. Los MNP desmoldados se empaquetan y almacenan en un ambiente estéril y seco hasta su uso.

Comparación de la carga de la punta (a) y la eficiencia de la carga de la punta (b) utilizando el proceso de fabricación de uno o dos pasos en función de la masa de proteína utilizada para dispensar. (c) Comparación de la masa de polímero (PVP:PVA) utilizada con la proteína (BSA) durante el primer paso del proceso de fabricación de dos pasos. La masa de polímero bajo es de 0,8 mg de PVP:PVA, mientras que la masa de polímero alto es de 4 mg y 8 mg de PVP:PVA para 100 µg y 200 µg de BSA, respectivamente. Se utilizó un ANOVA ordinario de dos vías (prueba de comparaciones múltiples de Sidak) (n = 6 muestras independientes). ( d ) Masa relativa de albúmina de suero bovino (BSA) cargada para tres grandes lotes diferentes de MNP, normalizada al promedio. La prueba de Bartlett (p = 0,006) reveló que las desviaciones estándar podrían ser significativamente diferentes, y las pruebas t bilaterales entre los grupos revelaron que los parches dispensados ​​a 30 mm tenían una desviación estándar significativamente diferente de los otros dos grupos, que eran comparables a entre sí (n = 50 parches para artesanal; n = 40 parches para cualquiera de las alturas de dosificación estudiadas). ( e ) Eficiencia de carga por parche para 10 μg de una vacuna de ADN para n = 100 MNP fabricados con el MVP. Los datos representan la media ± sd Los valores de P están representados por: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. NS, no significativo.

(a) concentración encapsulada de ARNm, (b) eficiencia de encapsulación de ARNm y (c) diámetro de LNP elaborados con dos lípidos ionizables diferentes (cKK-e12 o lípido 5) y codificación de ARNm encapsulante para fLuc o RBD (n = 3). ( d ) Viabilidad de las células HeLa medida en presencia de 0, 6 mg de formulación y 50 ng de ARNm encapsulado en LNP elaborados con cKK-e12 (n = 4 réplicas técnicas). ( e ) Tiempo total de secado para MNP hechos de diferentes formulaciones de polímeros que usan alcohol polivinílico (PVA) o polivinilpirrolidona (PVP10 o PVP60, 10 kDa o 60 kDa de peso molecular, respectivamente). Se estudiaron dos enfoques de secado diferentes: secado con flujo de nitrógeno durante 10 h antes del vacío o secado con desecante durante 24 h antes del vacío (n = 1). Los parches 100% PVP eran demasiado frágiles para quitarlos del molde sin fracturarse. ( f ) Rigidez y ( g ) fuerza máxima medida en pruebas de compresión de MNP cargados con mRNA-LNP hechos de diferentes polímeros. Se utilizó un ANOVA ordinario de una vía (prueba de comparaciones múltiples de Sidak) (n = 5 por grupo). (h) diámetro mrna-lnp medido por dispersión de luz dinámica (dls) inmediatamente después de la síntesis, después de la concentración, después de la formulación en tinta de vacuna y después del secado para formar la matriz MNP. (n = 3 por grupo). Imágenes representativas de microscopía electrónica de transmisión (TEM) y crio-TEM para (i) mRNA-LNP después de la síntesis, (j) mRNA-LNP en tinta de vacuna y (k) mRNA-LNP en parches de microagujas. ( l ) análisis de fragmentos de ARNm de ARNm-LNP de FLuc, ARNm de tinta de vacuna y ARNm de MNP, caracterizado mediante electroforesis capilar. ( m ) Distribución de ARNm encapsulado en las agujas de un parche de microagujas. ( n ) Histograma de carga de ARNm encapsulado por aguja. (o) carga de ARNm encapsulado y (p) eficiencia de carga por parche (n = 2 muestras independientes). ( q ) Expresión de proteínas después de la transfección de HeLa con LNP (6 réplicas técnicas) o las mismas LNP redisueltas del parche de microagujas (n = 2 muestras independientes, 6 réplicas técnicas por MNP). Los datos representan la media ± sd

(a) Dimensiones de una microaguja individual utilizada en parches de microagujas piramidales o cónicas. El espacio entre dos agujas adyacentes (paso) es de 1000 µm. ( b ) Imagen óptica representativa de la disolución de la aguja tras la aplicación ex vivo en piel de cerdo en función del tiempo para MNP de forma piramidal y cónica. ( c – e ) Comparación entre microagujas cónicas y piramidales hechas de PVP: PVA 2: 1 y 1: 1, en términos de volumen disuelto en piel de cerdo ex vivo. Pruebas t de dos colas no apareadas (n = 23–59 agujas por grupo). Los datos representan la media ± sd Los valores de P están representados por: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. NS, no significativo.

( a ) Esquema de la secuencia RBD del SARS-CoV-2 de las construcciones de ARNm utilizadas en este documento. La secuencia señal (SS) es de color naranja, el dominio RBD es de color azul y el motivo de trimerización de T4 es de color verde. ( bc ) Los LNP que encapsulan el ARNm que codifica fLuc se mezclaron con varios polímeros solubles en agua y se secaron. Los LNP se dializaron en PBS o en agua DI antes de mezclarlos con la matriz polimérica. La expresión de proteínas en células HeLa se midió después de la transfección con polímero redisuelto para detectar una combinación de polímeros que produce una expresión de proteínas comparable a los LNP en suspensión (n = 4 réplicas técnicas). (dE) El tamaño de las gotas es crítico para una alta eficiencia de carga de vacunas. Debido al efecto Marangoni, un tamaño de gota más grande (d) tiene una eficiencia de carga más baja que una gota pequeña (e) dispensada en el centro de un molde. ( f ) Células HEK transfectadas con suspensión de LNP preparada con Lípido 5 y ARNm encapsulante que codifica RBD. Los LNP que encapsulan el ARNm que codifica RBD se disolvieron de un MNP y se agregaron para demostrar la bioactividad después de cargarlos en los MNP. RBD se muestra en verde (Alexa Fluor 488 utilizado como anticuerpo secundario), la actina se muestra en rojo (rodamina faloidina) y el núcleo en azul (DAPI). ( g ) Carga de punta de MNP ( h ) y eficiencia de carga de diferentes construcciones de ARNm-LNP utilizadas para estudios in vivo (n = 3 muestras independientes). Se administraron cuatro MNP para estudios in vivo a 1,5 μg por parche para producir una dosis teórica de 6 μg. (i) De los 6 μg de ARNm utilizados para la fabricación de MNP, evaluamos el porcentaje de ARNm recuperado en varias regiones del MNP. Aproximadamente el 25 % se encontró en las microagujas, coincidiendo con la medición de la eficiencia de carga, y el ARNm restante se encontró en el soporte. El total informado es la suma de agujas y respaldo, lo que muestra que todo el ARNm se contabilizó en el MNP (n = 5 muestras independientes). Los datos representan la media ± sd

(a) Régimen de inmunización para experimentos in vivo en ratones C57BL/6. ( b ) Cinética de la expresión de ARNm de FLuc medida por luminiscencia. Se administró 1 μg de ARNm en ARNm-LNP a ratones C57BL/6 mediante inyección intramuscular (IM) o aplicación de parche con microagujas (MNP) (n = 5 muestras biológicamente independientes). Las expresiones de ARNm alcanzan su punto máximo más tarde para los MNP en comparación con la suspensión de ARNm-LNP. ( c ) Expresión de FLuc después de 1 mes de almacenamiento a 37 ° C en PVP: PVA 1: 1 MNP mRNA-LNP. Se utilizó un ANOVA ordinario de dos vías (prueba de comparaciones múltiples de Sidak) (n = 5 muestras biológicamente independientes). (d) Inmunogenicidad de parches de microagujas almacenados durante 1 mes (1 mes) o 3 meses (3 meses) usando un ensayo de electroquimioluminiscencia que mide la fuerza de las respuestas de unión del dominio de unión del receptor de la proteína S del SARS-CoV-2. Todos los ratones BALB/c se cebaron con una dosis de 10 μg de ARNm de SARS-CoV-2 RBD mediante inyección intramuscular (IM). En la semana 4, se aplicó una dosis de refuerzo que varió según el tiempo y las condiciones de almacenamiento, excepto en un grupo que no recibió refuerzo para comparar. El suero se recolectó a las 3 semanas (antes del refuerzo) ya las 9 semanas (después del refuerzo) (n = 5 muestras biológicamente independientes). Los datos representan la media ± sd NS, no significativo.

Notas complementarias 1–4 y Tabla complementaria 1.

Película S1.

Película S2.

Película S3.

Película S4.

Película T5.

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Reimpresiones y permisos

vander Straeten, A., Sarmadi, M., Daristotle, JL et al. Una impresora de vacunas con microagujas para vacunas termoestables de ARNm de COVID-19. Nat Biotechnol (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-023-01774-z

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Recibido: 10 enero 2022

Aceptado: 30 de marzo de 2023

Publicado: 24 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-023-01774-z

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