Trampa óptica de sub

Sep 14, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8615 (2023) Citar este artículo

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Mientras que las pinzas ópticas (OT) se utilizan principalmente para confinar partículas de tamaño más pequeño, las trampas de doble haz de contrapropagación (CP) han sido un método versátil para confinar partículas de tamaño pequeño y grande, incluidas muestras biológicas. Sin embargo, las trampas CP son sistemas sensibles complejos que requieren una alineación tediosa para lograr una simetría perfecta con valores de rigidez de trampa bastante bajos en comparación con OT. Además, debido a sus fuerzas relativamente débiles, las trampas de CP están limitadas en el tamaño de las partículas que pueden confinar, que es de aproximadamente 100 μm. En este artículo, se analiza y se demuestra experimentalmente una nueva clase de pinzas ópticas de contrapropagación con una simetría rota para atrapar y manipular partículas de más de 100 μm dentro de medios líquidos. Nuestra técnica explota un solo haz gaussiano que se repliega sobre sí mismo de forma asimétrica formando una trampa CP capaz de confinar partículas pequeñas y significativamente más grandes (hasta 250 μm de diámetro) basándose únicamente en fuerzas ópticas. Según nuestro conocimiento, tal captura óptica de muestras de gran tamaño no se ha demostrado antes. La simetría rota de la trampa combinada con la retrorreflexión del haz no solo ha simplificado significativamente la alineación del sistema, sino que también lo ha hecho resistente a desalineaciones leves y mejora la rigidez de la trampa, como se muestra más adelante. Además, nuestro método de captura propuesto es bastante versátil, ya que permite atrapar y traducir una amplia variedad de tamaños y formas de partículas, que van desde una micra hasta unos pocos cientos de micras, incluidos los microorganismos, utilizando potencias de láser muy bajas y óptica de apertura numérica. Esto, a su vez, permite la integración de una amplia gama de técnicas de espectroscopia para obtener imágenes y estudiar la muestra atrapada ópticamente. Como ejemplo, demostraremos cómo esta técnica novedosa permite la captura simultánea en 3D y la microscopía de hoja de luz de gusanos C. elegans con una longitud de hasta 450 µm.

Los láseres permiten interacciones luz-materia únicas que conducen a fuertes fuerzas ópticas, manipulación y captura de partículas1,2,3,4,5,6,7,8. El atrapamiento óptico es una herramienta versátil con muchas aplicaciones que ha permitido una gran cantidad de estudios fundamentales, revolucionando numerosos campos de la ciencia y la ingeniería desde su descubrimiento9,10,11,12,13,14,15. La implementación más básica pero poderosa de las trampas ópticas es la trampa de fuerza de gradiente de un solo haz, conocida como pinzas ópticas16,17,18. En este método, la trampa se forma cuando un rayo láser se enfoca lo suficientemente cerca como para que las fuerzas ópticas ejercidas sobre la partícula de interés la confinen. Estas fuerzas se clasifican en general en dos contribuciones principales. Una de ellas son las fuerzas de gradiente que atraen partículas con un índice de refracción más alto con respecto al medio de fondo hacia regiones con mayor intensidad de láser. El segundo son las fuerzas de dispersión que principalmente empujan las partículas a lo largo de la dirección de propagación del haz. Las últimas fuerzas pueden contrarrestar el atrapamiento de partículas, lo que lleva a una trampa inestable, especialmente para partículas más grandes (por encima de 10 μm). Por lo tanto, encontrar un enfoque práctico para compensar los efectos adversos de las fuerzas de dispersión es un paso crucial en el atrapamiento óptico estable. Una solución común es el uso de objetivos de microscopio de alta NA (apertura numérica), para enfocar con precisión el haz de modo que las fuerzas de gradiente aumenten hasta el punto de superar las fuerzas de dispersión en la dirección axial. Tal enfoque generalmente requiere objetivos de microscopio con aperturas numéricas superiores a uno (de ahí el tipo de inmersión). Esto da como resultado una distancia de trabajo corta, un campo de visión estrecho e intensidades locales extremas que generalmente entran en conflicto con las necesidades de las aplicaciones prácticas, especialmente en biología. Otro enfoque que puede evitar las desventajas antes mencionadas es el uso de dos haces idénticos de contrapropagación (CP) moderadamente enfocados 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Aquí, cada haz equilibra las fuerzas de dispersión hacia adelante del otro, generando estabilidad axial para formar una trampa 3D entre los focos de los dos haces. Este atrapamiento óptico dentro de las suspensiones se ha logrado usando objetivos de NA alta25,26, objetivos de NA baja19,31, dos fibras20,32,33,34, trampas de espejo óptico35,36,37,38,39,40,41, fase óptica conjugación42, trampas holográficas de contrapropagación23,37,40 y ondas estacionarias ideales para atrapar nanopartículas21,22,23,24,35,36,37,38,39. En estas configuraciones de captura de CP, dado que la captura ocurre entre los focos que están separados por decenas de micras, no solo se alivia el fotodaño, sino que también se hace posible el confinamiento de partículas más grandes de hasta 100 μm (conocidas como macro-trampas)36,37,41 .

Sin embargo, dado que la trampa se forma entre los dos focos y ligeramente alejada del foco del haz (a diferencia del OT), las fuerzas de gradiente y, por lo tanto, los valores de rigidez de la mayoría de estos métodos de atrapamiento de haz CP son bastante pequeños31,36,40. En consecuencia, esto podría dar lugar a cierto movimiento lateral y rotación lenta del objeto, especialmente en el caso de las macrotrampas41. Además, su rigidez de atrapamiento es muy sensible a la alineación perfecta, lo que se debe a los requisitos de simetría de las trampas de haz CP. Como resultado, no solo la alineación de los métodos de doble haz CP podría ser un desafío, sino que también el posicionamiento preciso de las partículas y las mediciones de fuerza se limitarán a las configuraciones de captura CP. Este problema se exacerba si se aumenta la distancia de los focos para extender el rango de manipulación de partículas. Esto se debe al hecho de que para las trampas CP, las fuerzas ópticas y, por lo tanto, la estabilidad de la trampa dependen en gran medida de la separación de los focos31,36,43. Las preguntas que surgen aquí son las siguientes: ¿podemos modificar la configuración de la viga CP dual para simplificar la complejidad de la alineación y, en consecuencia, reducir la sensibilidad de la rigidez de atrapamiento a una simetría perfecta? ¿Y hay alguna manera de aumentar el límite de tamaño de atrapamiento para confinar de manera estable las partículas de más de 100 μm?

En un estudio anterior, abordamos la primera pregunta utilizando haces duales de contrapropagación asimétrica (ACP) junto con el uso de componentes de baja NA para formar la trampa óptica44,45. Mostramos que la asimetría introducida en el sistema de dos vigas CP no solo aumenta la rigidez de atrapamiento (con respecto a las trampas de vigas CP tradicionales) sino que también permite que las fuerzas de dispersión axial se equilibren en una amplia longitud espacial. Esto, a su vez, otorgó un atrapamiento y una manipulación de partículas estables en un rango milimétrico en el que la rigidez del atrapamiento se mantuvo casi independiente de la separación de los focos.

En este documento, planeamos abordar la segunda pregunta con respecto a la captura de partículas más grandes, pero para hacerlo primero analizaremos una configuración significativamente menos compleja para crear trampas ACP que la presentada anteriormente44. Demostraremos por qué este sistema es sustancialmente más fácil de alinear y muestra mucha menos sensibilidad a las desalineaciones. A continuación, se estudian las propiedades de captura del sistema propuesto, mostrando su capacidad para manipular fácilmente partículas de largo alcance dentro de medios líquidos. Nuestros hallazgos indican valores mejorados de rigidez de la trampa en comparación con las trampas CP duales simétricas convencionales, cuando se utilizan condiciones experimentales similares. Más tarde, observamos las aplicaciones del sistema de haces ACP propuesto para atrapar objetos significativamente más grandes, especialmente muestras biológicas alargadas como gusanos C. elegans con diferentes longitudes (hasta 450 µm), usando solo fuerzas ópticas. Finalmente, demostramos cómo las técnicas de imágenes espectroscópicas, como la microscopía de fluorescencia de hoja de luz, se pueden integrar fácilmente en este sistema de captura estable para generar imágenes más detalladas, sin movimiento de la muestra.

En el sistema de captura de doble haz ACP44, a diferencia de la configuración tradicional de haces CP simétricos, utilizamos dos ópticas diferentes con distancias focales muy diferentes para crear la trampa. Para ello, en un lado de la muestra se coloca una lente con una distancia focal larga de 15 cm (por lo tanto, largo alcance de Rayleigh), mientras que en el otro lado se coloca un objetivo de NA baja (de 0,25 a 0,4 dependiendo del tamaño de las partículas). . Entonces, mientras un lado crea un foco relativamente estrecho (como OT), el otro lado genera un haz casi colimado dentro de la cámara de muestra, propagándose en la dirección opuesta. En tal sistema, mientras que el objetivo permite el confinamiento 2D (lateralmente), los dos haces ACP trabajan juntos para equilibrar las fuerzas de dispersión (axialmente), creando una trampa 3D estable. Dado que uno de los dos haces actúa colimado dentro de la muestra, a medida que se traduce el enfoque más estrecho de sus haces que se propagan en sentido contrario, la trampa se desplaza sin cambios perceptibles en la estabilidad durante cientos de micras, como se muestra más adelante. Tenga en cuenta que debido al objetivo de baja NA utilizado, se evitan los efectos térmicos.

En este trabajo, para generar la trampa ACP, usamos un sistema más simplificado en comparación con nuestro trabajo anterior44 que usa solo un rayo láser entrante, como se observa en la Fig. 1a, que se describe a continuación. Un rayo láser que ingresa al sistema desde la izquierda es enfocado por una lente (fl = 15 cm), formando el primer foco con un largo rango de Rayleigh (zr ≈ 650 µm). Luego, este haz es recolectado por un objetivo de microscopio de baja NA y dirigido al espejo final (M) y se pliega sobre sí mismo, mientras pasa dos veces a través de una rueda de filtro de densidad neutra variable (VND) en su camino, lo que permite ajustes de potencia. El haz retrorreflejado va directamente a la apertura trasera del mismo objetivo del microscopio y llega a un foco más estrecho (el segundo foco) en algún lugar dentro de zr del primer foco, mientras se propaga en la dirección opuesta formando la trampa de haz ACP. Cada haz por sí solo no puede atrapar una partícula, sino que la empuja. Solo a través de la sinergia de los dos rayos, podemos generar una trampa 3D estrecha que puede ocurrir en cualquier punto dentro y más allá de zr, controlado por la ubicación del objetivo. La figura 1b muestra el paisaje potencial generado por las vigas ACP. Para obtener la Fig. 1b, calculamos la presión de radiación debida a todos los haces incidentes como \({\mathrm{S}}_{\mathrm{z}}/\mathrm{c}\), donde \({\mathrm{S }}_{\mathrm{z}}\) es el vector de Poynting total en la dirección axial y \(\mathrm{c}\) es la velocidad de la luz. Para obtener el paisaje potencial de la Fig. 1b, realizamos una integral de trayectoria de la presión de radiación en la dirección \(\mathrm{z}\) desde un punto de referencia arbitrario hasta la ubicación de interés. El resultado es un potencial cuyo gradiente produce la presión de radiación en cada punto del eje óptico. La Figura 1c demuestra la configuración utilizada en nuestro laboratorio para crear la trampa ACP que incluye imágenes de vista frontal y lateral. Aquí, para tener imágenes de vista frontal, reemplazamos el espejo en la Fig. 1a con un filtro de muesca (NF) que actúa como un espejo para el rayo láser que forma la trampa, mientras transmite todas las demás longitudes de onda. El objetivo (MO1) es responsable tanto de la imagen de vista frontal como de generar un enfoque más preciso para el reventado óptico. Por esta razón, se encuentra en un escenario motorizado, por lo que la ubicación exacta de su foco está bajo nuestro control. Además, se coloca una placa de cuarto de onda (\(\lambda /4\)) en el sistema de manera que cambia la polarización del haz retrorreflejado, evitando la formación de ondas estacionarias. En comparación con las trampas CP duales convencionales, nuestra configuración es significativamente menos compleja, más fácil de alinear y más robusta frente a desalineaciones leves con una rigidez de trampa axial mayor en general, como se muestra más adelante. Estos se deben principalmente al uso de un único haz retrorreflejado, ópticas de NA baja y la simetría rota de los haces que forman la trampa, alrededor de su centro.

Configuración de trampa ACP retrorreflectante con un haz entrante: (a) la idea básica de la formación de trampa ACP: el único haz entrante que ingresa a la configuración desde la izquierda, pasa a través de la lente para crear un foco suelto con un largo rango de Rayleigh que es colimado por un objetivo de microscopio de baja NA y se pliega sobre sí mismo por el espejo final (M). VND es rueda de filtro de densidad neutra variable. (b) Es una simulación del sistema ACP, que demuestra la formación de un pozo potencial para la trampa asimétrica, cuando el foco del objetivo está a 500 µm del foco de la lente. (c) La configuración ACP retrorreflectora utilizada en nuestros experimentos: Láser de 830 nm (MSquared Equinox SolsTiS PI), L1 y L2: dos lentes con f1,2 = 15 cm, L1 en combinación con MO1 (Olympus 20×/0.40 o Olympus 10x/0,25 según el tamaño de las partículas) crea una trampa 3D basada en un único haz ACP retrorreflectante. Si es necesario, MO1 permite la vista frontal y el seguimiento, mientras que L2 se usa para la imagen frontal. MO2: objetivo de 4× (Olympus 4×/0,1) a 20× (Olympus 20×/0,40) utilizado para la vista lateral. MO1 está montado en una plataforma motorizada (MS) que se mueve axialmente. BE expansor de haz, WL luz blanca, NF Filtro de muesca de 830 nm que refleja un haz de 830 nm, DM espejo dicroico, S: muestra y una placa de cuarto de onda (\(\lambda /4\)) para cambiar la polarización de los haces en 90° después atravesándolo dos veces. Las dos cámaras son cámaras CMOS.

Hay muchos estudios que utilizan un haz CP retrorreflejado para atrapar y manipular nanopartículas21,24,35,36,37,38,39 mediante la generación de ondas estacionarias o micropartículas36,40,41,43 entre dos focos apretados decenas de micras de distancia. Sin embargo, demuestran valores relativamente bajos para la rigidez de la trampa que depende en gran medida de la separación de los focos31,36,43. Esto, a su vez, limita el rango de manipulación a decenas de micrones como máximo y los bajos valores de rigidez dan como resultado el movimiento y la rotación de partículas que pueden reducir la calidad de la imagen en ciertas técnicas de microscopía que requieren tiempos de escaneo más largos. Como veremos en breve, el sistema de captura ACP propuesto aquí no solo aumenta la rigidez de la trampa, sino que también mantiene su valor casi independientemente de la distancia de los focos, lo que permite atrapar, administrar o generar imágenes de partículas y microorganismos más grandes sin ningún movimiento.

Para los sistemas de trampa CP convencionales en general, debido a la óptica NA más baja utilizada (con respecto a OT), las fuerzas de gradiente son más pequeñas, especialmente porque la trampa se forma entre los focos debido a la simetría perfecta. Estas fuerzas son aún más débiles si la separación de los focos se aumenta a decenas de micras para aumentar el rango de manipulación31,36,43. En este caso, el atrapamiento axial se debe simplemente al equilibrio de las fuerzas de dispersión. Sin embargo, en el caso de las trampas ACP, debido a la ruptura de la simetría de las vigas, los valores de rigidez se pueden mejorar significativamente ajustando juiciosamente las relaciones de potencia de modo que la trampa no se forme en algún lugar entre los focos, sino en la ubicación de la enfoque más estricto. En este caso, mientras que las fuerzas de dispersión axial todavía están equilibradas, las fuerzas de gradiente laterales que siente la partícula son mucho más fuertes debido a su proximidad al foco más estrecho. Esto se debe a que un haz está casi colimado (por cientos de micras) mientras que el otro está mucho más enfocado, divergiendo rápidamente, reduciendo así su presión de radiación lejos de su foco. En consecuencia, al ajustar las relaciones de potencia podemos crear el equilibrio axial en la ubicación del foco más estrecho y, a medida que este foco se traslada (al mover el objetivo), también lo hace la posición de la trampa, como se ilustra esquemáticamente en la Fig. 2a. Aquí, la ubicación axial del pozo de potencial (posición de la trampa) generada por el haz ACP está completamente dominada por la posición del foco más estrecho, como se muestra en la Fig. 1b. En esta figura, el foco de la lente está en la posición cero mientras que el foco del objetivo está a 500 µm de distancia y, como se ilustra en la gráfica, la ubicación del pozo de potencial generado coincide con el foco del objetivo.

Comportamiento de traducción de partículas: (a) Una demostración esquemática de la traducción de la posición de la trampa moviendo el objetivo MO1. ( b, c ) Resultados experimentales de la traducción de una partícula atrapada de 5 μm (perla de poliestireno) en agua a lo largo de los haces ACP a medida que MO1 se traduce en pasos de 100/1,33 μm en el espacio libre (que se refiere a 100 μm en agua). ( b ) Mediciones de rigidez de trampa axial y lateral en función de la posición de la trampa dentro de la suspensión para la partícula confinada de 5 μm. ( c ) Relación experimental encontrada entre la traslación objetiva axial en el aire y la posición de partículas axiales dentro de la suspensión.

Utilizando la configuración que se muestra en la Fig. 1c, donde L1 tiene fl = 15 cm y MO1 es un objetivo de 20x con NA = 0,4, generamos la trampa ACP para confinar una perla de poliestireno de 5 µm dentro de una cubeta de cuarzo de 1 mm de ancho llena de agua. Las potencias de láser utilizadas son de 50 mW y 25 mW en lente (L1) y objetivo (MO1), respectivamente. Se pueden usar potencias más bajas, pero eso reduce la rigidez de la trampa. Una vez que una partícula caía en la trampa (que coincidía con la ubicación del foco de MO1), podía trasladarse hacia delante y hacia atrás a lo largo de los haces ACP moviendo MO1. Las mediciones experimentales del comportamiento de desplazamiento de una partícula atrapada debido a la traslación axial del objetivo y el valor de rigidez de la trampa en diferentes ubicaciones en una longitud de 1 mm se muestran en la Fig. 2b, c. En la gráfica (b), el foco de la lente se fijó en la ubicación de la pared del lado izquierdo de la cubeta y el objetivo se movió con respecto a esta pared en incrementos de 100 µm/nagua fuera de la cámara de muestra y hacia la derecha, donde nagua = 1,33. El valor de incremento corresponde a un desplazamiento de 100 µm del foco de MO1 dentro del agua. Como se muestra en la Fig. 2c, la partícula atrapada sigue el desplazamiento de MO1 con una relación casi uno a uno hasta la posición de 500 µm dentro de la muestra. Después de eso, comienza a desviarse y la partícula se traslada un poco menos, y la línea comienza a doblarse. Esta desviación ocurre porque a medida que la partícula se aleja más del foco de la lente, las fuerzas de dispersión (presión de radiación axial) impuestas por el haz moderadamente enfocado (por la lente L1) comienzan a disminuir más notablemente. En consecuencia, esto conducirá a que la trampa se forme ligeramente lejos del foco más estrecho, que es donde se equilibran las fuerzas axiales.

También caracterizamos la estabilidad de la trampa ACP en función de la ubicación de las partículas dentro de la cámara de muestra, midiendo las rigideces axial y lateral (κz, κx). La figura 2b ilustra los resultados de las mediciones de rigidez de la trampa después de cada 100 µm de traslación axial de partículas dentro de la suspensión, hasta 1 mm de longitud. En estas mediciones se utilizó el método PSD (densidad de espectro de potencia), y en cada ubicación las mediciones se repiten 10 veces para las direcciones axial y lateral y se promedian para encontrar κz y κx, respectivamente. La PSD se encuentra rastreando la partícula durante 10 s, usando una cámara CMOS de vista lateral con 1000 fps. El primer y el último punto de datos se miden a 25 µm de la pared para evitar efectos superficiales. Como se observa en la Fig. 2b, los valores de rigidez axial y lateral permanecen casi constantes a medida que movemos la posición de la trampa hasta ~ 500 µm. En este rango, los valores de rigidez medidos promedio son κx = 7,7 pN/µm y κz = 3,8 pN/µm, que son aproximadamente un orden de magnitud mayores que las rigideces de trampa CP convencionales informadas anteriormente6,36,40,41 donde se han obtenido parámetros experimentales similares. usado. La razón de este aumento en los valores de rigidez que demostramos aquí se debe a la asimetría de nuestro sistema que hace que la trampa se forme muy cerca del foco del objetivo, lo que resulta en fuerzas de gradiente mejoradas que siente la partícula que es independiente de la separación de focos de hasta ~ 500 micras. Para las trampas CP convencionales, debido a la perfecta simetría, la trampa se forma en el medio de los focos y, dependiendo de su distancia, las fuerzas de gradiente sobre la partícula y, en consecuencia, los valores de rigidez podrían ser significativamente menores. A medida que trasladamos la partícula más allá del rango de Rayleigh de la lente, permaneció confinada, pero las rigideces de trampa medidas disminuyeron. Este resultado está de acuerdo con la curvatura de la línea observada en la gráfica 2c y se debe a que la ubicación de la trampa se desvía del foco del objetivo a medida que la partícula se aleja más del rango de Rayleigh de la lente. Esta desviación reduce las fuerzas de atrapamiento del gradiente que siente la partícula, lo que conduce a una disminución de los valores de rigidez.

Usando exactamente la misma configuración, pudimos atrapar y trasladar partículas de poliestireno con diámetros entre 1 y 100 µm, dentro de una suspensión acuosa. Esta capacidad del sistema junto con los resultados presentados en la Fig. 2 demuestra la flexibilidad del sistema ACP en la captura y manipulación de partículas. La capacidad de traducir y controlar la ubicación axial de la trampa con precisión de micras durante varios cientos de micras es bastante única. Estas propiedades son muy diferentes de las trampas CP convencionales en las que solo se puede mover una partícula atrapada decenas de micras antes de que escape de la trampa. Además, en el caso de trampas CP simétricas, si el foco de un objetivo se mueve una distancia d dentro de la muestra, la partícula atrapada se mueve d/2. Todas estas diferencias surgen de la asimetría aquí introducida.

Para investigar más a fondo las propiedades de las trampas ACP retrorreflejadas y en qué se diferencian de las trampas CP convencionales, modelamos teóricamente las fuerzas axiales de ambos sistemas utilizando parámetros similares a los utilizados en nuestros experimentos. Los resultados de este estudio se analizan brevemente aquí y se pueden encontrar con más detalles en la figura complementaria S1. Nuestros cálculos muestran que para la trampa ACP, incluso en separaciones de focos grandes (de más de 500 µm), la partícula aún puede estar confinada debido a las fuertes fuerzas ópticas existentes. Este resultado está de acuerdo con nuestros resultados experimentales presentados en la Fig. 2 y explica por qué podemos trasladar fácilmente una partícula atrapada a cientos de micrones. Por otro lado, nuestros hallazgos teóricos para la trampa CP simétrica contrastan con los de la trampa ACP (con valores de rigidez lateral comparables). Para la trampa CP simétrica, si la separación de los focos supera las decenas de micras, sus fuerzas axiales se vuelven demasiado pequeñas y una trampa 3D estable se vuelve imposible. Este resultado está de acuerdo con informes previos sobre trampas CP convencionales donde su rigidez de atrapamiento es una fuerte función de la separación de los focos36,43 y cae rápidamente a medida que aumenta la separación de los focos. Esto, a su vez, limita el área de manipulación a decenas de micras para las trampas CP. En otro estudio teórico, investigamos la capacidad de traducción de trampas ACP y CP cambiando solo las relaciones de potencia de los dos lados. Nuestros resultados que se muestran en la figura complementaria S1a indican que cambiar las relaciones de potencia en cualquier caso moverá la ubicación de la trampa solo en decenas de micras. En general, nuestros hallazgos del estudio de la fuerza axial sugieren cómo la asimetría introducida en el sistema de atrapamiento CP convencional puede ampliar significativamente el rango de fuerza óptica y, en consecuencia, aumentar nuestro control sobre la ubicación exacta del atrapamiento dentro de una trayectoria milimétrica.

Hasta ahora, solo hemos demostrado el confinamiento de partículas pequeñas utilizando la trampa ACP retrorreflejada propuesta. Sin embargo, como pronto veremos, esta técnica es muy adecuada para atrapar partículas de macrotamaño significativamente más grandes que pueden ser esféricas o no esféricas. En esta sección, comenzaremos con la captura 3D de perlas de poliestireno grandes y luego demostraremos el confinamiento de muestras biológicas vivas. Primero usando la configuración en la Fig. 1c (donde MO1,2 son objetivos 10x con NA de 0.25) pudimos atrapar perlas de poliestireno de 150 µm dentro de una suspensión acuosa como se ilustra en la Fig. 3a. El video de este confinamiento se encuentra en la Visualización complementaria 1. Agregamos perlas de poliestireno de 10 µm a la suspensión, con fines de comparación, como se ve en la Fig. 3a. También pudimos trasladar la partícula de 150 µm moviendo lentamente MO1. La secuencia de imágenes que muestran la traslación de esta perla se presenta en la Visualización complementaria 2. La potencia del láser utilizada para atrapar una perla de polímero tan grande fue de 100 mW en total: 67 mW del haz que sale de la lente L1 y 33 mW del haz retrorreflejado que sale MO1 y entrando en la muestra. Es importante señalar que en una investigación anterior48 se atrapó una esfera de polímero de 100 µm entre dos fibras con un poder de captura de 800 mW de cada brazo de fibra. En comparación con ese estudio, los niveles de potencia utilizados en nuestro estudio son significativamente más pequeños y la partícula atrapada aquí es 1,5 veces más grande. La potencia bastante pequeña requerida para atrapar, junto con la capacidad de confinar objetos mucho más grandes, indica que la trampa de haz ACP es una herramienta ideal para atrapar muestras biológicas.

Reventado de objetos mucho más grandes en micras utilizando el sistema de reventado ACP retrorreflejado. Confinamiento de: (a) perlas de poliestireno de 150 µm, (b) Volvox de 115 µm y (c) microorganismos vivos Micrasterias Waris de 250 µm.

Luego, usando la misma configuración y parámetros, pudimos atrapar fácilmente microorganismos vivos Volvox de 115 µm (Fig. 3b) y Micrasterias Waris de 250 µm (Fig. 3c) dentro del agua. El video de Micrasterias Waris atrapado está disponible en la visualización complementaria 3.

Muchas muestras biológicas son alargadas o tienen forma de varilla, como cromosomas, orgánulos intracelulares, una amplia variedad de bacterias y parásitos, túbulos de membrana, ciertas microalgas y microgusanos. El atrapamiento óptico de tales muestras generalmente requiere sistemas complejos que involucran la conformación del haz. En consecuencia, el atrapamiento óptico 3D de partículas en forma de varilla en una orientación específica puede ser un desafío o imposible. Aquí, al integrar un segundo rayo láser en el sistema de atrapamiento ACP retrorreflectante, como se muestra en la Fig. 4, podemos atrapar fácilmente objetos alargados o en forma de varilla como se describe a continuación. El segundo haz, que se elige a una longitud de onda ligeramente diferente (λ = 785 nm con ~ 30 mW) se combina con el haz retrorreflejado de 830 nm utilizando un DM (espejo dicroico), ambos ingresando a MO1 mientras se copropaga. Los dos rayos pasan a través de la muestra (B2 y B3 en la Fig. 4a) enfocándose en dos ubicaciones separadas, donde su distancia puede controlarse simplemente moviendo la lente L3 (fl = 15 cm que cambia la divergencia del rayo láser de 785 nm). La combinación de los tres haces (B1, B2 y B3 con ~ 80 mW, ~ 30 mW y ~ 30 mW, respectivamente) forma una trampa 3D para objetos alargados. Usando este sistema, atrapamos con éxito los microorganismos Paramecium aurelia (Fig. 4c) y Caenorhabditis elegans (C. elegans) (Fig. 4d, e). Los gusanos C. elegans confinados se encontraban en diferentes estadios larvales con varios tamaños que oscilaban entre 250 y 450 µm de longitud. Los medios de una larva (etapa L2) confinada en nuestra trampa dual ACP se pueden encontrar en la visualización complementaria 4.

(a) El esquema de los haces ACP de doble trampa propuestos para confinar objetos alargados utilizando una combinación de tres haces. B1 es el haz de 830 nm enfocado a través de L1 (fl = 15 cm) con un rango largo de Rayleigh, B2 es el haz retrorreflejado que se enfoca estrechamente a través de MO1 (Olympus 10×/0.25). B3 es un rayo láser de 785 nm también enfocado por MO1 ligeramente después del foco de B2. (b) Configuración modificada del haz ACP plegable para lograr el confinamiento 3D para objetos alargados. Aquí MO1 es 10× con NA 0.25, MO2 varió entre 4×, 10× y 20× objetivo según el tamaño del objeto y la aplicación. (c-e) son las imágenes de campo brillante de microorganismos atrapados ópticamente: (c) 130 μm Paramecium aurelia, (d) 260 μm, (e) 385 μm C. elegans larvas.

A continuación, agregamos microscopía de fluorescencia de hoja de luz al sistema de captura ACP ilustrado en la Fig. 4b para captura e imágenes 3D simultáneas de las larvas de C. elegans atrapadas. Para esta microscopía, las gotitas de lípidos en la larva se tiñeron con el tinte fluorescente rojo Nilo (un tinte lipófilo que emite fluorescencia en un entorno lipídico). Como se demuestra en la Fig. 5a, usamos un láser de 532 nm para excitar el gusano C. elegans teñido confinado. El haz se enfoca mediante una lente cilíndrica (CL con fl = 7,5 cm) en un espejo retrovisor (SM) y luego se transmite a la apertura trasera del objetivo MO3 (10x con NA de 0,3) mediante una combinación de lentes de relé (dos lentes idénticas L2 y L3 con fl = 5 cm). La fluorescencia se recoge perpendicular al plano de iluminación con un objetivo de microscopio de inmersión en agua (MO2) de 20x con NA de 0,6 y se refleja en la cámara CMOS de vista superior. La imagen de campo brillante de una larva de C. elegans teñida de 450 µm se muestra en la Fig. 5b. En la Fig. 5c se presenta un ejemplo de una imagen de lámina de luz seccional tomada paralelamente al plano en el que se encuentra la larva.

(a) La configuración óptica ampliada que muestra solo los objetivos y lentes que participan en la captura óptica (L1 y MO1) y la microscopía de fluorescencia de hoja de luz (MO2, MO3 y L2 a L4). Aquí: lente cilíndrica CL con fl = 7,5 cm, MO3 es un objetivo de 10× con NA de 0,3 (Olympus UPlanFL N 10×/0,30) mientras que MO2 es un objetivo de inmersión en agua de 20× con NA de 0,6 (Thorlabs TL20X-MPL 20×/ 0,60 W/400–900 nm \(\infty\)/WD 5,5 mm). L2 y L3 son sistemas de lentes de relé, ambos con fl = 5 cm. L4 con fl = 10 cm se utiliza para la formación de imágenes. (b) es la microscopía de campo claro de una larva de C. elegans teñida de 450 µm y (c) es la imagen de microscopía de fluorescencia de hoja de luz de la misma larva que se muestra en (b).

Cabe señalar aquí que para los objetos atrapados más pequeños (≤ 100 µm), no necesitábamos agregar MO3 para la microscopía de láminas de luz, ya que MO1 podría usarse tanto para atrapar como para formar láminas de luz. Esto podría lograrse fácilmente utilizando un espejo dicroico para combinar el láser de excitación (aquí 532 nm) con el haz retrorreflejado, antes de ingresar a MO1. Aquí solo hemos demostrado una posible técnica de imagen (microscopía de hoja de luz) que se integró fácilmente en nuestra configuración de captura óptica. Sin embargo, dado que nuestro sistema, a diferencia de la mayoría de los estudios anteriores, permite que los objetos de interés se confinen dentro de una cámara mucho más grande y sin una restricción física estricta (como usar un cubreobjetos o agarosa), permite la integración de una variedad de técnicas de imagen ( con un gran campo de visión) para estudiar mejor las muestras biológicas y su desarrollo. En consecuencia, nuestro sistema tiene el potencial de generar imágenes en 4D (imágenes en 3D a lo largo del tiempo) para estudiar dinámicas específicas en la biomateria.

En resumen, hemos demostrado cómo romper la simetría del conocido sistema de captura óptica de contrapropagación puede modificar las fuerzas ópticas generales, lo que conduce a una mayor estabilidad de captura y permite la captura y manipulación de partículas de largo alcance en medios líquidos. Si bien existen numerosos informes sobre la manipulación de partículas de largo alcance a través de pinzas ópticas, la mayoría de ellos se realizan en medios de gas o vacío y se basan principalmente en fuerzas termoforéticas29,46,47. Aquí atrapamos y manipulamos una amplia gama de partículas con diferentes tamaños y formas, incluidos microorganismos, con el uso de fuerzas de presión de radiación y sin crear ondas estacionarias22 o efectos térmicos. Debido a la asimetría alrededor de la trampa creada por la combinación lente-objetivo, la sensibilidad de la rigidez de la trampa en la separación de focos es extremadamente reducida, lo que a su vez permite atrapar en una separación de focos extendida que no es posible con las trampas CP convencionales. Además, la simetría rota combinada con la retrorreflexión del haz y el uso de un solo objetivo de NA baja no solo ha simplificado significativamente la alineación, sino que también la ha hecho muy robusta y rentable. La configuración ACP propuesta ha aumentado las rigideces de atrapamiento axial en al menos un orden de magnitud con respecto a las vigas CP simétricas que tienen parámetros experimentales similares. Si bien nuestra configuración comparte la simplicidad y flexibilidad de una pinza óptica de un solo haz, permite el uso de objetivos con AN muy pequeños para atrapar partículas. Esto da como resultado una mayor distancia de trabajo y un campo de visión al tiempo que evita los efectos térmicos no deseados. Esto es de particular interés cuando se desea una captura y manipulación no invasiva de campo lejano dentro de medios líquidos. Todas estas ventajas hacen que este sistema sea muy práctico para el atrapamiento óptico de largo alcance para una variedad de muestras y permiten la posibilidad de integración de técnicas de microscopía basadas en espectroscopia, como se demuestra aquí. Vale la pena mencionar que, en los últimos años, técnicas como las trampas de espejo óptico36,37 (o macropinzas ópticas41) utilizan un espejo detrás de la muestra para formar haces de trampa que se propagan en sentido contrario, pero existen diferencias importantes. Si bien la mayoría de estos estudios utilizan un modulador de luz espacial (SLM), lo que hace que su configuración sea bastante compleja y costosa, el espejo retrorreflectante utilizado se coloca dentro de la cámara de muestra, lo que hace que la preparación de la muestra y las imágenes de vista lateral sean bastante desafiantes. En nuestro método propuesto, el espejo (que es un NF) se coloca lejos de la muestra, lo que permite el acceso lateral sin la necesidad de una preparación especial de la muestra o técnicas de imagen complicadas. Además, la asimetría única de nuestros haces de captura crea capacidades estables de manipulación y captura 3D de rango milimétrico con valores de rigidez mejorados ausentes en los estudios antes mencionados debido a la simetría de su haz.

Los datos no están disponibles públicamente, pero se pueden obtener de Shima Fardad previa solicitud razonable.

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Departamento de Ingeniería Eléctrica y Ciencias de la Computación, Universidad de Kansas, Lawrence, 66045, EE. UU.

Laurynas Lialys, Justinas Lialys, Alessandro Salandrino y Shima Fardad

I2S, Instituto de Ciencias de la Información, Universidad de Kansas, Lawrence, 66045, EE. UU.

Alessandro Salandrino y Shima Fardad

Departamento de Biociencias Moleculares, Universidad de Kansas, Lawrence, 66045, EE. UU.

Brian D. Ackley

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LL y JL diseñaron y configuraron el sistema, realizaron los experimentos y recopilaron los datos. SF, AS y BA escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Shima Fardad.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Información complementaria 4.

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Lialys, L., Lialys, J., Salandrino, A. et al. Atrapamiento óptico de partículas y microorganismos de tamaño submilimétrico. Informe científico 13, 8615 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35829-7

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Recibido: 02 de marzo de 2023

Aceptado: 24 de mayo de 2023

Publicado: 27 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35829-7

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